Neinvazivní detekce gonozomálních DNA sekvencí v plazmě gravidních žen s využitím kapilární elektroforézy

Souhrn

Cíl studie:
Cílem této práce byla optimalizace neinvazivní detekce pohlaví plodu z maternální plazmy.

Typ studie:
Molekulární kvantitativní analýza pomocí gonozomálních sekvencí plodu z plazmy gravidních žen.

Název a sídlo pracoviště:
Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny, Fakultní nemocnice Olomouc.

Metodika:
Do projektu bylo zahrnuto 475 vzorků DNA izolovaných z maternální plazmy periferní krve u žen v různých týdnech gravidity v rozmezí 4. t.g .– 37. t.g.

Y chromozomální sekvence v lokusech AMELX/Y a TSPY byly testovány pomocí upravené kvantitativní fluorescenční PCR s využitím laserem indukované fluorescence a kapilární elektroforézy.

Výsledky:
Na základě hodnocení artificiálních genotypických směsí je metodika schopna rozlišt i 1% příměs Y chromozomálních sekvencí. Při vyšetřování vlastních vzorků bylo dosaženo ve 4,05 % falešné pozitivity a v 7,15 % falešné negativity zachycení Y sekvencí v maternální plazmě.

Závěr:
Vypracovaná metoda umožňuje s velkou citlivostí stanovit fetální pohlaví a je jí také možno dále využít k relativním kvantifikacím.

Klíčová slova:
fetální DNA, maternální plazma, stanovení pohlaví, QF PCR, Y chromozomální sekvence.

ÚVOD

Analýzu fetálních molekul v maternálních tkáních lze rozdělit na 5 možných úrovní:

1. Analýza fetálních buněk kolujících v maternálním krevním řečišti - nejčastěji jde o fetální erytroblasty, kdy koncentrace těchto buněk je uváděna 1:10³-10⁷ [3, 8, 13]. Poměr fetálních buněk může být zvětšen až na 1-10:100. Nejčastěji se používá metodika MACS (magnetic cell sorting ) nebo FACS (fluorescence activated cell sorting) [1, 3, 7, 16]. K vlastní vizualizaci je používána metoda FISH. Největším úskalím FISH je, že 1–2 % normálních diploidních buněk dává 3 signály a 10–20 % trizomických buněk dává pouze 2 signály [12].
2. Dalším zdrojem fetálního materiálu mohou být fetální buňky v apoptóze. Tyto buňky lze rozlišit a detekovat pomocí některého z postupů ke zviditelnění apoptických buněk (Komet test, TUNEL test, Systémy založené na detekci kaspázové aktivity) [15].
3. Slibnou zvýšenou koncentraci fetálních molekul nabízí volná fetální DNA v maternálním plazmě (séru). Tato koncentrace je závislá na délce těhotenství a v průměru se pohybuje kolem 5 %. Tato koncentrace fetální DNA ve volné formě je téměř 1000krát větší než DNA v intaktních fetálních buňkách cirkulujících v maternální periferní krvi [10, 11].
4. V maternálních tkáních byla také prokázána RNA fetálního původu [2, 4, 5].
5. Za již rutinně a screeningově využívané diagnostické markery lze také považovat proteiny fetálního a placentálního původu v maternálním krevním oběhu (AFP, PAPPA, volná beta-podjednotka hCG apod).

Pro účely rozlišení a stanovení pohlaví neinvazivním přístupem lze poměrně snadno detekovat Y chromozomální sekvence u plodu mužského pohlaví. Většina technik, která detekuje tyto sekvence, je založena na Real-time PCR. Spolehlivé a rutinní stanovení pohlaví těmito metodami se stává již součástí praxe většiny špičkových pracovišť, které se zabývají neinvazivní prenatální diagnostikou. Cílem této studie bylo vypracování metodiky detekce gonozomálních sekvencí na kapilární elektroforéze, dále vlastní analýza na souboru těhotných žen a posouzení vhodnosti kapilární elektroforézy k této diagnostice.

MATERIÁL A METODIKA

V průběhu projektu bylo shromážděno celkem 475 vzorků DNA izolovaných z maternální plazmy periferní krve u žen v různých týdnech gravidity v rozmezí 4. t.g. až 37. t.g.

Všechny vzorky byly odebrány a vyšetřeny po informovaném souhlasu schváleném Etickou komisí FN Olomouc. Jednotlivé počty vzorků vzhledem k délce gravidity jsou znázorněny v grafu 1.

Izolace DNA z plazmy

Dvojnásobná centrifugace plné krve 10 min při 1500 RPM a poté 20 min při 2500 RPM. Vzorky byly zamraženy do dalšího zpracování při – 20 °C. Následovala izolace DNA kitem QiaAmp DNA mini kit (Qiagene). U každého vzorku byla měřena koncentrace pomocí spektrofotometru Beckman Coulter DU 530.

Použité gonozomální sekvence AMELX, AMELY, TSPY. Sekvence primerů a jejich lokalizace jsou volně dostupné na www.gdb.org. Pro detekci všech lokusů byly použity primery značené FAM a TET fluorofory.

K amplifikaci plazmatické DNA byl používán pouze termocykler MJ Research.

Amplifikace volné DNA izolované z maternální plazmy

K amplifikaci DNA z plazmy byly testovány polymerázy: Taq DNA Polymerase od firmy Fermentas, dále Combi PPP Master Mix od firmy Top Bio a Restorase polymerase od firmy Sigma Aldrich. Pro vlastní analýzu byla zvolena Restorase polymeráza vzhledem ke spolehlivosti, reproducibilitě a množství naamplifikovaného PCR produktu. Z důvodů restorázové aktivity použitého enzymu bylo nutné zavést primery typu Big Band (Sigma Aldrich).

50 μl PCR směs obsahovala 5 μl pufru, 1 μl 5U polymerázy, 1 μl 10mMdNTPs, 1 μl 10pM primery, 20 μl templátové DNA, 22 μl deionizované vody.

PCR podmínky

94 °C/3 min, (94 °C/60 sec, 55 °C/90 sec, 72 °C/2 min) 40-60x opakování, 72 °C/7 min, 10 °C inkubace.

Pro separaci v kapiláře byl využit genetický analyzátor ABI PRISM 310. Jako separační gel byl použit polymer POP4 TM (Applied Biosystems). Separace probíhala ve 47 cm dlouhé kapiláře o průměru 50 μm.

Podmínky elektroforézy

Nasátí vzorku: 3 kV – 15 kV po dobu 5 s – 15 s. Vlastní elektroforéza: 25 min při teplotě 60 °C při napětí 15kV. Pro stanovení velikosti jednotlivých fragmentů byly analyzované vzorky smíchány s velikostním standardem Tamra 500. Ke snímání a digitalizaci hrubých dat fluorescence byl používán software ABI PRISM 310 Data Collection. K vlastní analýze snímaných dat byl využíván software 310 GeneScan 3.1.2 (Applied Biosystems). Ke kvantitativním analýzám byl použit parametr RFU (relativní fluorescenční jednotka) vyjádřený výškou peaku.

VÝSLEDKY

Množství izolované plazmatické DNA se pohybovalo v rozmezí od 14 ng/μl do 180 ng/μl s mediánem 46,5 ng/μl. Z grafu 2 vyplývá, že přímý vliv délky těhotenství na kvantitu izolované DNA z maternální plazmy nebyl spektrofotometrickým měřením koncentrace DNA prokázán (graf 2).

Optimalizace

Gonozomální sekvence byly optimalizovány a posuzovány s využitím lokusů v genech AMELX, AMELY a TSPY. Velikosti molekul byly zvoleny: AMELX 103bp, AMELY 109bp a TSPY 398bp. Graf 3 posuzuje možnosti rozlišit od sebe genotypy u 1 %, 2 %, 5 %, 10 % a 20 % XY příměsí v genotypu XX. Jednotlivé parametry byly posuzovány průměrem 4 nezávisle analyzovaných vzorků (graf 3).

Obrázek 1 představuje ukázku elektroforetogramu genotypů XX/XY v poměru 49/1.

Vlastní detekce

Celkem bylo ze 475 vzorků analyzováno 253 plazmatických DNA s obsahem plodu mužského pohlaví a 222 plazmatických DNA s obsahem plodu ženského pohlaví (obr. 2).

Pohlaví bylo ověřeno pomocí:

1. detekce gonozomů z plodové vody nebo choriových klků,
2. kontrolního UZ vyšetření,
3. dotazem po porodu.

Shoda ženského pohlaví byla počítána na základě předpokladu alespoň jedné nulové hodnoty AMELY nebo TSPY pro ženské pohlaví a shoda mužského pohlaví byla posuzována podle zastoupení AMELY a TSPY ve všech vzorcích. Neshoda byla v případě ženského pohlaví nalezena ve 4,05 % a v případě mužského pohlaví v 7,15 %.

DISKUSE

Kvantitativní analýzy našeho souboru vykazovaly velkou heterogenitu a interindividuální variabilitu, která je v souhlasu s publikovanými pracemi [7, 8].

Vzhledem k možné chybné interpretaci a falešné pozitivitě je správné odečtení minoritního paeku rozhodující pro další výpočty. Kritéria hodnocení by měla být nastavená tak, aby byla možnost misinterpretace minimalizována:

1. peak se shoduje velikostně s paternální alelou s tolerancí Ī 1 báze;
2. výška peaku je prokazatelně minimálně 1,5násobkem pozadí, které je počítáno pro analyzovanou barvu v okolí Ī 15bp jako průměrná hodnota všech fluorescenčních peaků při maximálním roztažení dat.

Metodika vykazuje velmi vysokou citlivost detekce, která je srovnatelná s citlivostí Real-Time PCR metodiky [6, 9, 14].

Hlavní příčiny falešné pozitivity záchytu mužského pohlaví (4,05 %) spočívají především v možné kontaminaci vzorků během vlastního odběru a v průběhu izolačního postupu. Minimalizace jakékoli kontaminace patří mezi elementární při citlivých DNA analýzách, ve kterých je nutné zachytit genotyp v množství kolem 5 %. Zabezpečení spolehlivé izolace umožňuje např. některý z automatických izolačních přístrojů.

Do neshody mužského pohlaví (falešně negativní výsledky) je nutné započítat i testy z raných fází těhotenství, kdy je množství volné fetální DNA na hranici detekovatelnosti, takže spíše než neshoda by mohly být tyto výsledky posuzovány jako nezachycení fetální DNA.

Kapilární elektroforéza se ukázala jednoznačně jako schopná zachytit i 1% genotypovou příměs. Výsledek vlastních vyšetření na uvedeném souboru těhotných žen lze považovat za velmi uspokojivý. Metodika je připravená k praktickému využití, přesto dalším zdokonalováním a automatizací laboratorních postupů může být specificita, senzitivita i kvantita fetální DNA ještě upřesněna.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR7817-3.

RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D.

Vedoucí DNA laboratoře

Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny

Fakultní nemocnice Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail vrtel@fnol.cz