DNA hypermetylace tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 u hyperplazie endometria

Souhrn

Cíl: Zjistit míru metylací DNA vybraných genových promotorů u jednotlivých typů hyperplazie endometria ve srovnání s normální endometriální tkání. Soubor a metodika: Byla použita MS-MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Porovnáno bylo celkem 120 vzorků tkáně endometria; 40 vzorků s atypickou hyperplazií endometria, 40 vzorků s hyperplazií endometria bez atypií a 40 kontrolních vzorků tkáně zdravého endometria. Výsledky a závěry: Rozdíly v metylaci DNA mezi jednotlivými skupinami byly zjištěny v genech TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 (TWIST1: atypická hyperplazie 67,5 %, benigní hyperplazie 2,5 %, normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; GATA4: atypická hyperplazie 95,0 %, benigní hyperplazie 65,0 %, normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; MUS81: atypická hyperplazie 57,5 %, benigní hyperplazie 22,5 %, normální endo-metrium 5,0 %; p < 0,00001; NTRK1: atypická hyperplazie 65,0 %, benigní hyperplazie 27,5 %, normální endometrium 10 %; p < 0,00001). U genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 byla pozorována vyšší míra metylace u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky zdravého endometria a dále byla vyšší míra metylace pozorována u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky benigní hyperplazie endometria. Metylace DNA u tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 se uplatňuje v patogenezi atypické hyperplazie endometria.

Klíčová slova:

hyperplazie endometria – metylace – epigenetika – NTRK1 – TWIST1 – GATA4 – MUS81

Úvod

Hyperplazie endometria je patologický stav charakterizovaný nadměrnou proliferací endometriálních buněk. Nejčastější příčinou hyperplazie endometria je hormonální nerovnováha mezi estrogenem a progesteronem, tedy hormony ovlivňujícími růst a regeneraci endometria. Nedostatek progesteronu vůči estrogenům může vést k nadměrnému růstu endometria. Hyperplazie endometria je přirozenou odpovědí endometriální tkáně na růst stimulující efekt estrogenů. Mezi predispoziční faktory hyperplazie endometria patří obezita, kdy může docházet ke zvýšené produkci estrogenů v tukové tkáni aromatizací testosteronu na estrogen, což následně vede k proliferaci až hyperplazii endometria. Dalšími faktory jsou syndrom polycystických ovarií, nádory produkující estrogeny, pozdní menopauza a užívání neoponovaných estrogenů, kdy dlouhodobé užívání estrogenní léčby bez doprovodné progesteronové terapie opět může zvýšit riziko hyperplazie.

Dle Světové zdravotnická organizace (WHO) dělíme hyperplazii endometria do dvou kategorií [1]:

• hyperplazie endometria bez atypií (synonymum: benigní hyperplazie endometria);
• atypická hyperplazie endometria/endometrioidní intraepiteliální neoplazie (EIN).

 

Atypická hyperplazie endometria je pokládána za prekancerózu v užším slova smyslu, která může progredovat až do endometroidního typu endometriálního karcinomu (EC), který je jedním z nejčastějších zhoubných nádorů ženského pohlavního ústrojí [2].

Změny endometria ve smyslu hyperplazie se obvykle objevují po menopauze, kdy s ukončením pravidelné ovulace přestanou ovaria produkovat progesteron, tyto změny jsou ale již běžné v období perimenopauzy, kdy už samotná nepravidelnost ovulace a následně cyklu může vyvolat tyto hyperplastické změny na endometriu [3]. Nejčastějšími příznaky hyperplazie endometria jsou abnormální děložní krvácení vč. menoragie, krvácení mimo cyklus, postmenopauzální krvácení, dále i nepravidelné krvácení při hormonální substituční terapii nebo léčbě tamoxifenem [4,5].

Přibližně u 25–40 % pacientek s diagnostikovanou atypickou hyperplazií endometria se bez léčby následně vyvine karcinom endometria. U 13–43 % pacientek s atypickou hyperplazií se vyskytuje karcinom endometria již současně. Naproti tomu riziko maligní transformace benigní hyperplazie endometria během následujících 20 let od stanovení diagnózy je < 5 % [6]. Vznik invazivního karcinomu u pacientek s benigní hyperplazií je tedy poměrně vzácný, naopak atypická hyperplazie je pro vysoké riziko rozvoje v karcinom endometria považována za prekancerózu. Z toho vyplývá, že k léčbě benigní a atypické hyperplazie je nutné přistupovat odlišně. Atypická hyperplazie obvykle vyžaduje radikální léčbu ve smyslu hysterektomie, u benigní hyperplazie lze postupovat konzervativně – observačně. V některých případech může být použita hormonální léčba, např. progestinová terapie, a to i u diagnózy atypické hyperplazie [7]. Správné histologické zařazení a rozlišení benigní hyperplazie a atypické hyperplazie je zásadní pro volbu další terapie.

V procesu karcinogeneze hrají významnou roli epigenetické změny. Mohou ovlivňovat klíčové geny související s kontrolou buněčného dělení, reparací DNA a programovanou buněčnou smrtí. Nejvíce studovanou epigenetickou alterací je metylace DNA, kdy dochází k navázání metylové skupiny na cytosinové báze v DNA. Hypermetylace u tumor supresorových genů může způsobit snížení jejich exprese, což vede k nekontrolovanému buněčnému dělení. Naopak hypometylace může aktivovat onkogeny, geny podporující nádorový růst. Změny v metylaci DNA tumor supresorových genů jsou časným krokem v karcinogenezi endometriální tkáně [8]. V naší předchozí práci byly prokázány rozdíly v metylaci DNA tumor supresorových genů mezi jednotlivými typy hyperplazie u některých z 25 vybraných tumor supresorových genů [9]. Vzhledem k velmi slibným výsledkům jsme se rozhodli pro analýzu získaných vzorků hyperplastického endometria a kontrolní skupiny zdravé endometriální tkáně další skupinou 24 tumor supresorových genů. Pro dobré zkušenosti byla použita sada sond MS-MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) kit ME 004.

 

 

Tab. 1. Demografická a klinická data žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyperplazií endometria a s nor- málním nálezem na endometriu. Tab. 1. Demographic and clinical data of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings.
	Kontrolní skupina n = 40	Benigní hyperplazie  n = 40	Hyperplazie s atypiemi   n = 40	p  n = 40
Věk – medián (IQR)	64 (54–71)	52 (50–60,5)	60 (51–66,8)	0,0022
BMI – kg/m2, medián (IQR)	27,3 (24,2–29,3)	28 (24–32,8)	33,8 (27,1–39,1)	0,00013
Hypertenze – četnost (%)	12 (30,0 %)	20 (51,3 %)	31 (77,5 %)	< 0,0001
Diabetes mellitus – četnost (%)	2 (5,0 %)	3 (7,7 %)	12 (30,0 %)	0,0034
Karcinom prsu – četnost (%)	4 (10,0 %)	1 (2,6 %)	0 (0 %)	0,085
Fumator – četnost (%)	2 (5,0 %)	3 (7,7 %)	2 (5,0 %)	0,796
Údaje jsou prezentovány jako medián (mezikvartilové rozpětí), kategoriální údaje jako n (%). Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně. Data are presented as median (interquartile range), categorical data as N (%). Significant values P are shown in bold. BMI – index tělesné hmotnosti, n – počet, IQR – mezikvartilové rozpětí

 

 

Soubor pacientek a metodika

Do studie bylo zařazeno celkem 120 vzorků třech typů tkání endometria – benigní hyperplazie endometria (n = 40), atypické hyperplazie endometria (n = 40) a vzorků zdravé endometriální tkáně (n = 40). Vzorky pochází od žen léčených na Porodnické a gynekologické klinice FN Hradec Králové. Všechny ženy byly léčeny v období od roku 2007 do roku 2014 a byly české národnosti. Vzorky normálního endometria byly získány od pacientek, které byly léčeny chirurgicky pro nemaligní diagnózy, např. prolaps dělohy nebo děložní leiomyomy. Parafinové bločky byly získány z archivu Fingerlandova ústavu patologie FN Hradec Králové. Všechny preparáty byly zrevidovány a případně reklasifikovány atestovaným patologem se subspecializací na gynekologickou patologii (JL). DNA byla extrahována z formalinem fixovaných parafinových vzorků pomocí soupravy Qiagen pro extrakci DNA (Hilden, Německo).

Studie byla schválena Etickou komisí FM Hradec Králové a výborem institucionální revizní komise (r.n. 20120-4 S21P).

 

Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)

V experimentální práci byl použit kit prob SALSA MLPA ME004 Tumour Sup.-4 (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands), který může analyzovat atypickou metylaci u 24 tumor supresorových genů. Sekvence prob, genová místa a pozice na chromozomu mohou být nalezeny na www.mlpa.com. Jednotlivé geny byly stanoveny pomocí dvou prob, které obsahovaly různá Hha1 restrikční místa. Experimentální postup byl proveden podle protokolu výrobce, s minimem modifikací.

DNA (100 ng) byla rozpuštěna v 5 μl TE-pufru (10 mM Tris·Cl; 0,5 mM EDTA; pH 9,0), denaturována a následně ochlazena na 25 °C. Po přidání směsi prob byly proby přes noc hybridizovány (16–18 hod) při 60 °C. Následně byly vzorky rozděleny na dva podíly: jedna polovina vzorku byla přímo ligována, zatímco druhá polovina vzorku byla společně s ligázou vystavena působení restrikční endonukleázy Hha1 (30 min při 49 °C). Toto štěpení způsobilo ligaci pouze nenaštěpené (metylované) DNA sekvence. Amplifikační PCR reakce byla provedena ve standardním termocykléru (GeneAmp 9700, Applied Biosystems) a využívala teplotní profil: 35 cyklů denaturace při 95 °C 30 s, annealing při 60 °C 30 s a extenze při 72 °C 1 min, zakončeno závěrečnou extenzí 20 min při 72 °C. Alikvoty PCR reakce (0,6 μl) byly smíchány s 0,2 μl vnitřního standardu GeneScan™ –500 LIZ^® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a 9,0 μl formamidu. Po denaturaci byly fragmenty separovány a kvantifikovány na ABI3130 kapilárním sekvenátoru a analyzovány pomocí GeneMapper 4.0 (oba Applied Biosystems). Plochy píků s odpovídající velikostí párů bází (bp) byly použity pro další zpracování dat. Poměr metylace byl získán následujícím výpočtem: Dm = (Px / Pctrl) Dig / (Px / Pctrl) Undig, kde Dm je poměr metylace, Px je plocha píku dané sondy, Pctrl je součet ploch píků všech kontrolních sond, Dig znamená HhaI štěpený vzorek a Undig neštěpený vzorek. Dm se může pohybovat od 0 do 1,0 (odpovídá 0–100 % metylované DNA). Na základě předchozích experimentů jsme považovali promotor za metylovaný, pokud Dm ≥ 0,2, což odpovídá 20 % metylované DNA [10]. Cut-off hodnotu jsme nastavili v závislosti na analýze kontrolních vzorků endometrií. CpG univerzálně metylovaná a nemetylovaná DNA (Zymoresearch, Irvine, CA, USA) byly použity v každém běhu jako kontroly.

 

Statistická analýza

Kvantitativní demografické a klinické charakteristiky byly porovnány pomocí neparametrické Kruskal-Wallisovy analýzy rozptylu s následným mnohonásobným porovnáváním Dunnovým testem. Hodnoty jsou prezentovány mediánem a mezikvartilovým rozpětím (IQR). Kvalitativní veličiny byly vyhodnoceny pomocí Fisherova přesného testu a jsou prezentovány absolutními a relativními četnostmi. U testů byla použita Bonferroni modifikace hladiny významnosti. Logistická regrese byla použita ke zhodnocení vlivu případných confounder faktorů. Zvolená hladina významnosti byla pro metylaci DNA a = 0,001, pro všechny další hodnocené parametry a = 0,05. Data byla vyhodnocena pomocí statistického software NCSS 2023 Statistical Software 2023 (NCSS, LLC. Kaysville, Utah, USA, ncss.com/software/ncss a IBM SPSS Statistics verze 29.0.1. – SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

 

Výsledky

Demografické a klinické charakteristiky studijní populace

Celkem bylo do studie zařazeno 120 vzorků endometria (40 vzorků atypické hyperplazie, 40 vzorků benigní hyperplazie a 40 vzorků zdravé tkáně endometria jako kontrolní skupina) a demografické a klinické charakteristiky žen s ohledem na přítomnost benigní hyperplazie a atypické hyperplazie (tab. 1). Všechny proměnné, které byly v univerzální analýze významné (věk žen, body mass index – BMI, diabetes mellitus – DM a hypertenze – HT), byly považovány za potenciální záměnné faktory. Pomocí logistické regrese bylo zjištěno, že rozdílný výskyt genových promotorů mezi skupinami není confounder faktory ovlivněn.

 

Přítomnost metylace genů u žen s normální tkání endometria, s benigní hyperplazií a s atypickou hyperplazií

Rozdíly v metylaci DNA mezi jednotlivými skupinami byly zjištěny v promotorech genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1 (TWIST1: atypická hyperplazie 67,5 %; benigní hyperplazie 2,5 %; normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; GATA4: atypická hyperplazie 95,0 %; benigní hyperplazie 65,0 %; normální endometrium 22,5 %; p < 0,00001; MUS81: atypická hyperplazie 57,5 %; benigní hyperplazie 22,5 %; normální endometrium 5,0 %; p < 0,00001; NTRK1: atypická hyperplazie 65,0 %; benigní hyperplazie 27,5 %; normální endometrium 10,0 %; p < 0,00001) (tab. 2). U promotoru GATA4, TWIST1, MUS81 a NTRK1 byla pozorována vyšší míra metylace u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky zdravého endometria (GATA4 p < 0,001; TWIST1 p < 0,001; MUS81 p < 0,001 a NTRK1 p < 0,001), dále byla vyšší míra metylace pozorována u vzorků s atypickou hyperplazií endometria v porovnání se vzorky benigní hyperplazie endometria (GATA4 p < 0,01; TWIST1 p < 0,001; MUS81 p < 0,01 a NTRK1 p < 0,01). Rozdíl v míře metylace ve skupině benigní hyperplazie v porovnání se skupinou zdravých endometrií byla pouze u protomoru GATA4 a TWIST1 (GATA4 p < 0,001; TWIST1 p < 0,05). Naopak nebyly nalezeny signifikantní rozdíly v míře metylace u promotoru MUS81 a NTRK1 mezi vzorky skupin benigní hyperplazie a zdravého endometria (tab. 3).

 

 

Tab. 2. Frekvence metylace DNA vybraných genů u podskupin žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyperplazií endometria a s normálním nálezem na endometriu. Tab. 2. DNA methylation frequency of selected genes in subgroups of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings.
Geny	Kontrolní skupina  n = 40	Benigní hyperplazie n = 40	Hyperplazie s atypiemi n = 40	p  n = 40
EPHB2 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	1 (2,5)	1
BCL2 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	2 (5,0)	0,328
KLLN – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	4 (10,0)	0,0338
NF1(a) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	8 (20,0)	0,000275
RARRES1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
PRPF31 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
TERT – četnost (%)	4 (10,0)	2 (5,0)	8 (20,0)	0,134
THBS1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
SFRP1(a) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	1 (2,5)	1
IGF2R(a) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	2 (5,0)	0,328
NF1b – četnost (%)	2 (5,0)	0 (0)	1 (2,5)	0,772
BRCA1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
TWIST1 – četnost (%)	9 (22,5)	1 (2,5)	27 (67,5)	< 0,00001
APAF1(a) – četnost (%)	5 (12,5)	9 (22,5)	17 (42,5)	0,00896
PCDH15 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
PCNA – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
DNAJC15 – četnost (%)	39 (97,5)	32 (80,0)	38 (95,0)	0,0276
NTRK1 – četnost (%)	4 (10)	11 (27,5)	26 (65,0)	< 0,00001
PXMP4(a) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
MEN1(a) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
LMNA – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
OPA1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
APAF1(b) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
PCCA – četnost (%)	0 (0)	1 (2,5)	4 (10,0)	0,125
PAX6 – četnost (%)	2 (5,0)	3 (7,5)	8 (20,0)	0,139
BMPR2 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
RBM14 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
MUS81(a) – četnost (%)	2 (5,0)	9 (22,5)	23 (57,5)	< 0,00001
IGF2R(b) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
SFRP1(b) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	1 (2,5)	1
GATA4 – četnost (%)	9 (2,5)	26 (65,0)	38 (95)	< 0,00001
RANGAP1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
PXMP4(b) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
LEPRb – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
MEN1(b) – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
JAG1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
MUS81 – četnost (%)	1 (2,5)	1 (2,5)	1 (2,5)	1
WIF1 – četnost (%)	1 (2,5)	7 (17,5)	8 (20,0)	0,032
CDH1 – četnost (%)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	–
Údaje v kategorii jsou prezentovány jako n (%). Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně. – nelze vypočítat, protože žádná ze skupin neobsahuje metylovaný gen Data in a category are presented as N (%). Significant values P are shown in bold. – cannot be calculated because none of the groups contain a methylated gene n – počet

 

 

Tab. 3. Rozdíly v metylaci DNA vybraných genů u podskupin žen s atypickou hyperplazií endometria, s benigní hyper- plazií endometria a s normálním nálezem na endometriu. Tab. 3. Differences in DNA methylation of selected genes in subgroups of women with atypical endometrial hyperplasia, benign endometrial hyperplasia and normal endometrial findings. Geny                                   Kontrolní vs. benigní                     Kontrolní vs. hyperplazie                                         Benigní hyperplazie hyperplazie                                         s atypiemi                              vs. hyperplazie s atypiemi
TWIST1	0,0143*	0,0001***	< 0,00001***
NTRK1	0,0834	< 0,00001***	0,0015**
MUS81	0,0476	< 0,00001***	0,0027**
GATA4	0,0003***	< 0,00001***	0,0015**
Významné hodnoty p jsou uvedeny tučně. *, **, *** je určena hladina významnosti po Bonferroni modifikaci (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Significant values P are shown in bold. *, **, *** is the significance level after Bonferroni modification (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001).

 

 

Diskuze

Karcinogeneze je obecně způsobena pozvolnými genetickými změnami, které jsou závislé na množství vnitřních a vnějších faktorů. DNA metylace je epigenetický proces, který hraje důležitou roli v regulaci genové exprese a chromatinové struktury. V kontextu karcinogeneze dochází k různým změnám v DNA metylaci, což může ovlivnit regulaci genů a přispět k nekontrolovanému růstu buněk. Vzhledem ke své stabilitě v biologických vzorcích se DNA metylační změny jeví jako atraktivní biomarker různých typů onemocnění a jsou potenciálním cílem pro terapeutické intervence [11]. Všechny vzorky byly přezkoumány patologem, jenž se gynekologické onkologii věnuje dlouhodobě a systematicky. Vzhledem k tomu, že byl hodnocen pouze vybraný panel nádorových supresorových genů, mohli jsme analyzovat v jeden moment vybrané spektrum tumor supresorových genů.

Tato studie prokázala významné aberantní změny v metylaci DNA tumor supresorových genů, konkrétně TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1.

 

TWIST1

TWIST1 (twist family BHLH transcription factor 1) je gen, který kóduje transkripční faktor bHLH (basic helix-loop-helix). Tento faktor je zapojen do regulace genové exprese, regulace růstu a migrace buněk, angiogeneze a osteogeneze. Ovlivňuje procesy spojené s embryonálním vývojem a tvorbou orgánů. Za fyziologických podmínek je jeho exprese regulována, ale v některých patologických stavech, vč. nádorových onemocnění, může docházet k její deregulaci, což může přispět k nádorovému růstu a invazi [12]. Mutace genu TWIST1 je spojována s karcinomem prsu nebo také se Sézaryho syndromem, vzácným typem lymfomu kůže [13,14]. TWIST1 byl identifikován jako jeden z faktorů zapojených do procesu epiteliálně-mezenchymální transformace (EMT), což je klíčový proces při invazi a metastazování nádorových buněk [15].

TWIST1 jako transkripční faktor může ovlivňovat i běžné buněčné procesy v endometriální tkáni. Byla zjištěna hormonální závislost exprese TWIST1 v souvislosti s normální fyziologií endometria během menstruačního cyklu a byla také popsána spojitost hypometylace TWIST1 genu s následnou expresí TWIST proteinu s patogenezí endometriózy [16]. Dále byla popsána významně vyšší exprese TWIST1 u pacientek s atypickou hyperplazií a endometroidním karcinomem oproti kontrolní skupině zdravého endometria, naopak u exprese TWIST1 mezi skupinami atypického endometria a endometroidního karcinomu již nebyl signifikantní rozdíl [17]. To koreluje s našimi výsledky metylace TWIST1, kdy byl statisticky významný rozdíl hypermetylace TWIST1 genu ve skupině atypické hyperplazie (67,5 %) oproti skupině benigní hyperplazie (2,5 %) i skupině zdravých endometrií (22,5 %).

Exprese TWIST1 může dále úzce souviset s hloubkou nádorové invaze, metastazováním a prognózou u pacientek s endometroidním adenokarcinomem endometria [18]. S obdobnými závěry přichází studie zabývající se expresí TWIST1 u kolorektálního karcinomu. Exprese TWIST1 zde významně koreluje s rizikem metastatického postižení, stadiem onemocnění a s tím souvisejícím kratším intervalem přežití a zdá se být klíčovým prediktorem progrese onemocnění [19].

 

GATA4

GATA4 je gen kódující protein GATA-binding protein 4. Tento protein patří do skupiny transkripčních faktorů GATA, která hraje klíčovou roli v regulaci genové exprese, zejména během vývoje a diferenciace buněk. Gen GATA4 je významný především v kontextu embryonálního vývoje, zejména pro správný vývoj a funkci srdce a trávicího systému [20].

GATA4 je také důležitý pro vývoj endokrinních orgánů, jako jsou vaječníky, nadledvinky a pankreas. Má vliv na správnou diferenciaci a funkci buněk v těchto orgánech [21].

Mutace, ztráta exprese nebo naopak nadměrná exprese faktorů GATA4 jsou spojeny s celou řadou nádorových onemocnění, vč. leukemie, karcinomu prsu, rakoviny zažívacího traktu a dalších. Potlačení exprese GATA4 na podkladě hypermetylace promotorových sekvencí byla popsána ve většině buněčných linií rakoviny tlustého střeva a žaludku a stejně tak i u velké části karcinomu jícnu a plic [22–25]. Metylace GATA4 byla pozorována také u gynekologických malignit – karcinomů vaječníků a endometroidního karcinomu endometria [26]. Výsledky v této studii prokazují signifikantně vyšší metylaci GATA4 (81,5 %) ve skupině karcinomů ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých endometrií (0 %) [26]. Všechny tyto závěry podporují hypotézu, že potlačení exprese GATA4 na podkladě metylačních změn může přispívat k nádorové maligní transformaci.

Výsledky naší studie zaměřené na přednádorové stavy endometriální tkáně prokazují signifikantní rozdíly v metylacích GATA4 u vzorků hyperplazie endometria s atypiemi (95,0 %) ve srovnání se zdravou tkání 22,5 %, stejně tak i v porovnání se vzorky benigní hyperplazie (65,0 %) Toto zjištění podporuje myšlenku významu metylace GATA4 v karcinogenezi endometria [26].

 

MUS81

Gen MUS81 není typicky považován za klasický tumor supresorový gen. MUS81 kóduje protein MUS81, který hraje roli v opravě DNA a v replikaci genomu. MUS81 může mít vliv na kontrolu buněčného cyklu, zejména na kontrolu G2/M fáze, kde dochází k finálním přípravám buňky na mitózu [27]. Zvláště v kontextu replikačního stresu, např. při rychlém buněčném dělení, může hrát MUS81 významnou roli. Některé studie naznačují, že dysregulace MUS81 nebo neobvyklá aktivace tohoto genu může být spojena s určitými typy nádorů [28]. Přesný charakter role MUS81 v onkogenezi a jeho případná úloha v tvorbě nádorů jsou stále předmětem výzkumu.

Exprese MUS81 byla popsána u hormonálně rezistentního karcinomu prostaty, karcinomu žaludku, hepatocelulárního karcinomu, karcinomu tlustého střeva nebo u serózního ovariálního karcinomu. Všechny tyto studie se dále shodují, že MUS81 má velmi významný vliv na protinádorový účinek chemoterapeutické léčby a jeho inhibice, případně popisovaný knockdown by mohly zvýšit chemosenzitivitu nádorových buněk [29–32]. Proto by MUS81 mohl představovat nový molekulární cíl pro chemoterapii některých nádorů [33].

MUS81 a jeho případné metylace v souvislosti s hyperplazií endometria či endometriálním karcinomem nebyly v literatuře popsány. V naší studii vyšel statisticky významný rozdíl v DNA metylaci MUS81 mezi skupinami atypické hyperplazie, benigní hyperplazie a zdravého endometria (atypická hyperplazie 57,5 %; benigní hyperplazie 22,5 %; zdravé endometrium 5,0 %).

 

NTRK1

NTRK1 je gen, který kóduje receptor s názvem tropomyosin receptor kináza A (TrkA). TrkA je členem rodiny neurotrofních receptorů, které jsou známé také jako neurotrofní receptorová tyrosinkináza. Za fyziologických podmínek regulují synapse v nervovém systému. Dojde-li k fúzi v rámci této skupiny genů, spustí se buněčná signální kaskáda, která může ovlivnit mnoho buněčných funkcí, vč. buněčného růstu, přežití a diferenciace neuronů během vývoje nervového systému [34,35].

Mutace v genu NTRK1, které vedou ke změnám v proteinu TRKA, mohou mít různé biologické důsledky, mohou přispívat k vývoji nádorů, jako je např. sekreční karcinom slinných žláz nebo papilární karcinom štítné žlázy, nebo se mohou projevovat rozvojem některých neurologických poruch, např. familiární dysautonomie (FD). Gen NTRK1 byl opakovaně zmiňován u děložních sarkomů, u subtypu s tzv. rekurentními genetickými fúzemi, jako je low-grade endometriální stromální sarkom (LGESS), high-grade endometriální stromální sarkom (HGESS) a inflamatorní myofibroblastický tumor (IMT). Incidence těchto nádorů se vzhledem k rostoucí dostupnosti molekulárního testování bude pravděpodobně dále zvyšovat [36,37]. V pátém vydání klasifikace nádorů ženských pohlavních orgánů WHO 2020 jsou klasifikovány nově vznikající jednotky, tzv. emerging entities, což jsou případy vřetenobuněčných nádorů dělohy s přestavbou genu NTRK1 [38]. NTRK1 byl dále zmíněn ve vztahu s jeho častější amplifikací u endometriálního karcinomu ve spojitosti s užíváním tamoxifenu (TAM) [39]. Spojitost NTRK1 a patologií endometria není dostatečně prozkoumána. Vztah hyperplazie endometria a metylace DNA NTRK1 nebyl doposud publikován. Z našich zjištěných výsledků je jasně patrný trend nárůstu frekvence metylací DNA NTRK1 v jednotlivých typech hyperplazie ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých endometriíí (10,0 %) vs. benigní hyperplazie (27,5 %) a atypické hyperplazie (65,0 %). Naše nálezy jsou v tomto ohledu prioritní.

V rámci onkologického screeningu je dnes již možné využití metylačních změn některých konkrétních genů. Některé jsou již v praxi zavedené, jiné jsou zkoumány v rámci studií a experimentů. Nejvíce využívané jsou v rámci screeningu kolorektálního karcinomu, karcinomu prsu, karcinomu plic či leukemie. Díky detekci metylace DNA příslušných genů v tělních tekutinách, například krevní plazmě, je možné volit tento minimálně invazivní přístup. Příkladem může být screening kolorektálního karcinomu průkazem metylace SEPT9 v plazmě [40].

 

Závěr

Naše výsledky prokazují metylační změny DNA u tumor supresorových genů TWIST1, GATA4, MUS81 a NTRK1. Předpokládáme, že by identifikace specifických vzorců DNA metylace u jednotlivých pacientek mohla vést k další personalizaci léčebného přístupu, který by zohledňoval individuální genetické a epigenetické charakteristiky tohoto nejčastějšího gynekologického nádoru.