Lokální protilátky proti spermiím a celkové hladiny imunoglobulinů v ovulačním cervikálním hlenu

Overview

Cíl studie:
Zajímali jsme se o vzájemný vztah mezi účinkem lokálních aglutinačních protilátek proti spermiím a celkovými hladinami sIgA a IgG v ovulačním hlenu.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika, LF UK a FN, Plzeň.

Metodika:
V ovulačním cervikálním sekretu dvanácti pacientek (26-31 let věku, průměr 29,6 let) jsme sledovali celkové s IgA a IgG pomocí radiální imunodifuze. Ke specifikaci protilátek proti spermiím jsme použili nepřímý smíšený anti-imunoglobulinový reakční test.

Výsledky:
Zjistili jsme průměrnou koncentraci sIgA 567,84 mg/l (0-1250,47) a IgG 23,57 mg/l (8,74–47,99). Protilátková aktivita proti spermiím převažovala u 6 pacientek v IgA, u 1 v IgG, u 1 v IgA a IgG a u 1 v IgA a IgM izotypu zároveň. U 3 pacientek jsme lokální protilátky proti spermiím neprokázali.

Závěr:
Potvrdili jsme předpoklad, že hladiny a hlavně účinek lokálních spermaglutinačních protilátek nekoreluje s hodnotami hladin celkově zhodnocených lokálních sIgA a IgG v ovulačním cervikálním hlenu.

Klíčová slova:
spermaglutinační protilátky, ovulační cervikální hlen, i-MAR-test.

ÚVOD

Děložní hrdlo představuje klíčový orgán pro zajištění sterility prostředí v děloze. Je sídlem lokální imunity, jednak buněčné, reprezentované T-lymfocyty, makrofágy a polymorfonukleáry a samozřejmě i humorální, kterou představují imunoglobuliny. Právě v endocervixu ženského reprodukčního ústrojí je lokalizováno maximum plazmatických buněk tvořících IgA a IgG. Přítomné imunoglobuliny (hlavně IgG a IgA) se zapojují do obrany proti místní infekci zastavením šíření cizorodé látky, jejím označením a připravením k fagocytóze a apoptóze.

Protilátky přítomné v endocervixu mají svůj původ jednak v plazmocytech, ale mohou pocházet i ze systémové cirkulace a také ze sekretů endometria a vejcovodů [3]. Je zajímavé, že v endocervixu převažují nesekreční formy IgA protilátek nad sekrečním IgA, plazmatické IgA totiž snadno prostupují do tekutin ženského pohlavního ústrojí, což je zřejmě dáno vysokým prokrvením a relativní prostupností cévní výstelky. Stejným způsobem se do endocervixu dostává i část IgG [4].

Hladiny protilátek v cervikálním hlenu u žen (ale studováno i u makaků) se obecně pod vlivem pohlavních hormonů mění v průběhu menstruačního cyklu, nejvyšších koncentrací dosahují během menstruace a klesají v období kolem ovulace [5, 12] na nejnižší hodnoty 1 den před ovulací a v den ovulace. Tato fyziologická situace nastává u zdravých plodných žen [10].

Různé práce [např. 2, 4, 6] udávají přítomnost protilátek proti spermiím zhruba u 5-10 % mužů a žen v reprodukčním věku. Ne vždy musí být přítomnost protilátek proti spermiím spojena se sníženou plodností, neboť záleží na výši titru a vazebné protilátkové síle. U infertilních párů je však prevalence přítomnosti protilátek reagujících se spermiemi výrazně vyšší (až 40 – 60 %).

Protilátky proti spermiím negativně zasahují do pohybu spermií v ženském rozmnožovacím ústrojí, protože zabraňují ascendentní penetraci mužských pohlavních buněk cervikálním hlenem [1, 2, 6, 7, 11]. Byly zjištěny rozdíly v ovlivnění pohyblivosti spermií v závislosti na místě, kde jsou protilátky navázány. Např. vazba protilátek IgA nebo IgG na bičík spermie je méně výrazná a lépe terapeuticky ovlivnitelná [2, 4, 6, 11] než v případě, že tyto protilátky (zvláště IgA nebo současně IgA s IgG) způsobují shlukování spermií hlavičkami, nebo hlavičkami a bičíky současně. V této situaci je schopnost spermie proniknout hlenem děložního hrdla do vyšších etážích ženského reprodukčního ústrojí výrazně omezena [6, 11-13]. Navíc navázané protilátky IgG mohou (na rozdíl od IgA) aktivovat komplementový systém s následným cytotoxickým poškozením spermie [4]. Navázané protilátky proti spermiím brání oplodnění také přímým zablokováním membránových antigenních struktur zapojených do interakce spermie-oocyt [4, 6, 8–13]. Zaměřily jsme se proto výzkumně na lokální hladiny imunoglobulinů a jejich antispermatozoidální aktivitu.

SOUBOR PACIENTEK

Do naší skupiny jsme náhodně zařadily 12 pacientek s poruchou plodnosti průměrného věku 29,6 let (26-31 let), které navštěvují Poradnu pro imunologii reprodukce při Gynekologicko-porodnické klinice LF UK a FN Plzeň. Pacientky podepsaly souhlas se zpracováním nadbytečných vzorků rutinně odebíraného ovulačního cervikálního hlenu (OCM).

METODIKA

Ovulační cervikální hlen (OCM) jsme odebíraly do sterilních kapilár pomocí speciální vakuované stříkačky a do vyšetření skladovali při –20 °C.

K určení protilátek proti spermiím jsme použily Indirect Mixed Antiglobulin Reaction Test (i-MAR-test, nepřímý smíšený antiimunoglobulinový test) prop IgG a IgA. Výhodou testu je možnost určení protilátkového izotypu. Soustředily jsme se i na izotypy IgG, IgA, IgM, IgE a umístění vazby protilátky na spermii (H-H, T-T, H-T; H = head, T = tail). Ovulační hlen jsme po přidání stejného objemu ¹/4% bromelinu zcentrifugovaly při 5 tis. ot/min (30 minut) a jeho supernatant pak použily k dalšímu rozboru. Provedení testu spočívá ve smíšení suspenze spermií, které jsou předtím senzitizovány spermaglutinačními protilátkami přítomnými v OCM, s polymerními částicemi, jež jsou obaleny humánními imunoglobuliny, na závěr po přidání antihumánního antiséra (anti-IgG, anti-IgA, anti-Igm, anti-IgE) a následné inkubaci ve vlhké komůrce dojde (při přítomnosti protilátek proti spermiím v OCM) ke vzniku smíšených aglutinátů, neboli pohyblivých shluků spermií, což sledujeme pod inverzním mikroskopem (Weiss Jena, 200-300x zvětšení). Jako pozitivní MAR-test obvykle hodnotíme shluknutí více než 40 % spermií se senzibilizovanými erytrocyty, při našem sledování jsme braly výzkumně v úvahu i nižší hodnoty.

Ke sledování hladin sIgA a IgG jsme použily komerční testy od firmy The Binding Site využívající metody radiální imunodifuze, jejímž principem je difuze antigenu (sIgA resp. IgG) z jamky přes gel, obsahující příslušnou monospecifickou protilátku. Komplexy antigen-protilátka vytváří precipitační prstenec. Průměry prstenců pak odečítáme pomocí lupy. V okamžiku ustálení rovnováhy mezi vznikem a zánikem komplexů (kompletace) existuje lineární vztah mezi čtvercem průměru prstence a koncentrací antigenu. Z měření průměrů prstenců u vzorků o známé koncentraci pak vytváříme kalibrační křivku. Koncentrace antigenu v neznámém vzorku pak odečítáme z kalibrační křivky (graf 1 – příklad kalibrační křivky pro sIgA).

VÝSLEDKY

Protilátková aktivita proti spermiím převažovala u šesti pacientek v IgA, u jedné v IgG, u jedné v IgA a IgG a u jedné v IgA a IgM izotypu zároveň. U tří pacientek jsme lokální protilátky proti spermiím neprokázaly. Naměřené koncentrace sekrečních imunoglobulinů se pohybovaly v rozmezí 0-1250,47 mg/l, průměrná koncentrace sIgA ve vzorcích byla = 567,84 mg/l. Hladiny IgG se pohybovaly v rozmezí 8,74-47,99 mg/l s průměrnou koncentrací IgG = 23,57 mg/l (tab. 1, graf 2, graf 3).

DISKUSE A ZÁVĚR

Z našich předchozích zkušeností víme, že hladiny sIgA a IgG jsou v období ovulace u fertilních žen v oblasti hrdla děložního mimořádně nízké nebo žádné. U tří pacientek jsme neprokázaly přítomnost jednotlivých imunoglobulinů ani antispermatozoidální aktivitu v této v lokalitě. Lokální tvorba protilátek závisí na počtu plazmocytů, které se nacházejí ve sliznicích ženského pohlavního ústrojí. Počet těchto buněk a lokální koncentrace prodělává výrazné změny v závislosti na menstruačním cyklu. Např. počet buněk tvořících IgA, IgM, a IgG protilátky je nejnižší v průběhu folikulární fáze cyklu. Významně se zvyšuje v období ovulace a svého maxima dosahuje v luteální fázi cyklu. Nejvýraznější zvýšení je prokázáno pro sekreční imunoglobuliny a tvorbu sekreční komponenty. Souvisí to mimo jiné se zvýšenou aktivitou epitelové výstelky [4]. Z naší studie vyplývá, že i u našich náhodně vybraných pacientek se sníženou plodností jsou zvýšené i celkové nespecifické protilátky, které jsou výsledkem mimořádné imunologické flexibility v oblasti děložního hrdla.

Specifická protilátková aktivita v našem sledování nekoreluje s nálezem celkových sIgA a IgG v OCM. U žen je však možné vidět zvýšenou přítomnost protilátek proti spermiím v případě chronických infekcí genitálního ústrojí. Zánětová reakce indukovaná infekcí poskytuje adjuvantní podněty nutné pro aktivaci imunitního systému [4].

Práce byla podpořena MSM 002 162 0812.

MUDr. Petra Hušáková
Nemocnice Teplice, o. z.
Gynekologicko-porodnické odd.
Duchcovská 53
415 29 Teplice
e-mail: husi@centrum.cz