Význam stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla

Cíl studie:
Protein p16 je důležitým inhibitorem buněčného cyklu a slibným diagnostickým a prognostickým faktorem u prekanceróz děložního hrdla. Cílem studie je zhodnocení významu imunohistochemického stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla.

Typ studie:
Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Plzeň, Univerzita Karlova Praha, Gynekologicko-porodnická klinika FN Plzeň.

Metodika:
Do studie bylo zařazeno 122 pacientek s kolposkopicky cílenou biopsií (CDB) a následným excizním výkonem na děložním hrdle (LEEP, konizace). U všech pacientek byla nezávisle stanovena exprese p16 pomocí imunohistochemie (IHC). Byla provedena analýza mezi výsledkem histologie z CDB, expresí p16 v CDB a finální histologií z excizního výkonu.

Výsledky:
Ve vzorcích z CDB byla u 44 pacientek diagnostikována CIN 1, u 61 pacientek pak CIN 2/3. Ve skupině s CIN 1 bylo 15 vzorků (34,1 %) p16 negativní, 29 vzorků (65,9 %) p16 pozitivní. Ve skupině CIN 1/p16 negativní byla pouze ve dvou vzorcích (13,3 %) stanovena CIN 2/3 v definitivní histologii, zatímco u CIN 1/p16 pozitivních vzorků byla CIN 2/3 v definitivní histologii stanovena v 19 případech (tj. 65,5 %) (statisticky významné, p < 0,05; Wilcoxonův test). V 60 případech CIN 2/3 z CDB bylo (98,4 %) p16 pozitivních a v 57 případech (93,4 %) byla potvrzena diagnóza CIN 2/3 v definitivní histologii.

Závěr:
Zjistili jsme, že v souboru 122 pacientek s CDB mělo ve skupině s CIN 1 stanovení p16 lepší prediktivní hodnotu pro definitivní histologii než vlastní histologický výsledek z CDB. Ve skupině CIN 2/3 bylo 98,4% p16 pozitivních, stanovení p16 v této skupině tak nemá prognostický vliv na finální histologii. K potvrzení těchto dat je nutná prospektivní studie.

Klíčová slova:
protein p16 – kolposkopicky cílená biopsie – CDB – imunohistochemie

ÚVOD

Kontrola buněčného cyklu

Buněčné dělení je ovlivňováno a řízeno kontrolními systémy, které koordinují jednotlivé fáze buněčného cyklu.

V buněčném cyklu je proliferační aktivita kontrolována inhibitory, které mohou zastavit cyklus v kontrolních bodech. První kontrolní bod buněčného cyklu je v G1 fázi před vstupem buňky do S fáze. Druhý kontrolní bod je v G2 fázi před zahájením mitózy (M).

Regulace buněčného cyklu je realizována specifickými proteiny. Jde o tzv. cyklin-dependentní kinázy (cdk) a cykliny. Cykliny mohou vytvářet s cdk funkční komplexy. Tyto komplexy jsou schopné fosforylovat příslušné proteiny, což je nezbytné pro progresi buněčného cyklu. V průběhu G1 fáze buněčného cyklu se naváže inaktivní cdk s cyklinem D a vytvoří aktivní komplex cyklin D/cdk, který fosforyluje protein pRb (protein Rb je produktem retinoblastomového genu a je klasickým antionkogenem).

Inaktivace (fosforylace) pRb umožní přechod buněk z G1 fáze do S fáze buněčného cyklu. A naopak – protein pRb v nefosforylované (aktivní) formě ve vazbě s dalším proteinem E2F působí jako supresor buněčného dělení (brání transkripci genů, jejichž produkty jsou potřebné pro průběh S fáze buněčného cyklu).

Účinkem komplexů cyklinu D/cdk4, 6 a cyklinu E/cdk2 dochází k fosforylaci proteinu pRb a transkripční faktor E2F je tímto uvolněn z komplexu s pRb. Volný transkripční faktor E2F aktivuje transkripci genů S fáze buněčného cyklu.

Inhibitory cdk inaktivují komplexy cyklin/cdk a fosforylace pRb je blokována. Mezi nejdůležitější patří p16 gen kódující inhibitor cyklin dependentních kináz 4 a 6 a nachází se na chromozomu 9p21. Tento antionkogen je inaktivován delecemi nebo mutacemi u mnoha lidských malignit [11].

Za fyziologických okolností protein p16 (produkt p16 genu) odbourává komplexy cyklin D/cdk 4, které inaktivují protein pRb fosforylací. Naopak aktivní forma proteinu pRb (tj. nefosforylovaná) inhibuje transkripci proteinu p16. To znamená, že systém pRb/p16 reguluje buněčný cyklus na přechodu z G1 do S fáze [2].

Změny v buněčném cyklu při infekci HPV

Po integraci papillomavirové DNA do genomu hostitelské buňky dochází k interakci virových onkoproteinů E6 a E7 vysoce rizikových HPV typů s produkty (proteiny) onkosupresorových genů – p53 a p105Rb, což následně vede k jejich funkční inaktivaci.

E7 uvolňuje transkripční faktor E2F z vazby na protein pRb a urychluje degradaci proteinu pRb a jemu příbuzných proteinů [9].

Již v roce 1994 byla zaznamenána tehdy nevysvětlitelně nízká hladina komplexů cyklin D/cdk4 v buňkách s mutovaným nebo viry inaktivovaným proteinem pRb [2]. Za důvod snížení hladiny komplexu cyklinu D/cdk4 byla později označena vysoká exprese inhibitoru cyklin dependentních kináz, proteinu p16 v buňkách s inaktivovaným proteinem pRb [10].

Snížení hladin komplexu cyklin D/cdk4 se týkalo zejména HPV transformovaného epitelu, včetně cervikálních dysplazií [8]. Nefunkční protein pRb v těchto lézích umožňuje nekontrolovatelnou proliferaci a není schopen inaktivovat transkripci proteinu p16. V cervikálních prekancerózách a nádorech vyvolaných HPV lze tedy prokázat zvýšenou expresi proteinu p16 [4]. Protein p16 je zodpovědný za snížení hladiny komplexů cyklin D/cdk4, ale funkčně se díky HPV inaktivaci proteinu pRb neuplatní.

Cílem studie je zhodnocení významu imunohistochemického stanovení proteinu p16 v managementu prekanceróz děložního hrdla. V pracích dosud publikovaných v literatuře [5, 6, 7] bylo popsáno, že stanovení p16 zpřesňuje diagnózu stanovovanou běžně ze vzorků barvených hematoxylinem-eozinem a pozitivita p16 může označovat léze s potenciálem progrese do prekancerózy vyššího stupně či invazivního karcinomu.

METODIKA

Do retrospektivní studie bylo zařazeno 122 pacientek s kolposkopicky cílenou biopsií (CDB) a následným excizním výkonem na děložním hrdle (LEEP, konizace). U všech pacientek byla nezávisle stanovena exprese p16 pomocí imunohistochemie (IHC). Byla provedena analýza mezi výsledkem histologie z CDB, expresí p16 v CDB a finální histologií z excizního výkonu.

Materiál z CDB byl fixován v 10% formolu; pro základní barvení hematoxylinem eozinem byly krájeny řezy silné 4 µm, pro imunohistochemické vyšetření s onkoproteinem p16 silné 2 µm.

Imunohistochemické vyšetření bylo prováděno elektronicky nastaveným protokolem v automatu BenchMark Ultra, Ventana/Roche. K vizualizaci reakce byl použit diaminobenzidin tetrahydrochlorid, k dobarvení jader metylenová modř. Použit byl CINtec Histology V-Kit od mtm laboratories AG. Všechna vyšetření měla provedenu vnitřní kontrolu.

Pro pozitivní reakci s p16 byla určující jaderná či jaderná/cytoplazmatická pozitivita; samotná cytoplazmatická pozitivita byla hodnocena jako p16 negativní.

Hodnocení výsledku reakce

Negativní – žádná pozitivita.

Ojediněle pozitivní – slabá pozitivita izolovaných buněk.

Fokálně pozitivní – pozitivita malých skupin buněk, typicky mimo bazální vrstvy epitelu.

Difuzně pozitivní – silná souvislá lineární pozitivita buněk, dále posuzovaná v rozsahu jednotlivých vrstev (třetin) výšky epitelu.

V rámci studie byla hodnocena jako pozitivní pouze difuzní pozitivita (kontinuální barvení bazálních nebo suprabazálních buněk) (obr. 1–6).

VÝSLEDKY

Výsledky histologie a imunohistochemického stanovení exprese p16 ve vzorcích z CDB a definitivní histologické výsledky z excizního výkonu jsou shrnuty v tabulce 1. Ve vzorcích z CDB byla u 44 pacientek diagnostikována CIN 1, u 61 pacientek pak CIN 2/3. Ve skupině s CIN 1 bylo 15 vzorků (34,1 %) p16 negativní, 29 vzorků (65,9 %) p16 pozitivní. Ve skupině CIN 1/p16 negativní byla pouze ve dvou vzorcích (13,3 %) stanovena CIN 2/3 v definitivní histologii, zatímco u CIN1/p16 pozitivních vzorků byla CIN 2/3 v definitivní histologii stanovena v 19 případech (tj. 65,5 %) (statisticky významné, p < 0,05; Wilcoxonův test). V 60 případech CIN 2/3 z CDB bylo (98,4 %) p16 pozitivních a v 57 případech (93,4 %) byla potvrzena diagnóza CIN 2/3 v definitivní histologii.

DISKUSE A ZÁVĚR

Je známo, že většina karcinomů děložního hrdla vzniká z cervikální intraepiteliální neoplazie (CIN), ale jen malá část progreduje do invazivního karcinomu. CIN 1 často regreduje, ale asi v 10–15 % případů progreduje do CIN 2/3 [1]. Z těchto důvodů je důležité v managementu pacientek s onemocněním děložního hrdla rozpoznat CIN 1 se sklonem k progresi do vyšších forem CIN [3]. Prediktivní hladina klinických a histologických charakteristik v určení rizika progrese nebo regrese CIN 1 je velmi nízká [12].

Onkoprotein p16 je produktem tumor supresorového genu. Zvýšená produkce proteinu p 16 v buňce napadené HR HPV je reakcí na zvýšenou replikační aktivitu viru. P16 se ve zvýšené míře nachází ve většině high-grade (HG) lézí. Jde o slibný prognostický faktor (biomarker) pro prekancerózy a karcinom děložního hrdla. V kontrastu působí CIN 2/3 pozitivita p16 oproti CIN 1 p16 variabilitě (CIN 1 může být p16 pozitivní, či p16 negativní ). Důležitým faktem je, že pouze difuzní pozitivita (kontinuální barvení bazálních nebo suprabazálních buněk) patrně představuje rizikový faktor v přechodu do HG léze [5]. Stanovení p16 může mít jak význam diagnostický (rozlišení CIN 1 vs. CIN 2/3), tak prognostický, kdy pacientky s CIN1 p16 pozitivním výsledkem z CDB představují skupinu žen se zvýšeným rizikem vývoje CIN2+ [13]. P16 pozitivní CIN 1 jsou pravděpodobně léze v přechodu do CIN 2.

V našem retrospektivním souboru 122 pacientek s CDB a následným excizním výkonem na děložním hrdle jsme zjistili, že ve skupině s CIN 1 v CDB má stanovení p16 lepší prediktivní hodnotu pro definitivní histologii než vlastní histologický výsledek z CDB. Ve skupině CIN 2/3 bylo 98,4 % p16 pozitivních a stanovení p16 v této skupině tak nemá prognostický vliv na finální histologii. K přesné specifikaci zařazení stanovení p16 do diagnostických a léčebných guidelines u prekanceróz děložního hrdla je zapotřebí provedení prospektivních studií na větších souborech pacientek.

MUDr. Martin Pešek

Gynekologicko-porodnická klinika

Fakultní nemocnice

Alej Svobody 80

304 60 Plzeň