Korelácia výskytu PIK3CA mutácií v karcinóme prsníka s histologickými vlastnosťami nádoru

Overview

Ciele práce:
Zistiť prítomnosť mutácií v exóne 9 (kódu-júci helikálnu doménu) a 20 (kódujúci kinázovú doménu) génu kódujúceho katalytickú podjednotku alfa u fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát 3-kinázy (PIK3CA) v DNA získanej z parafínových rezov od pacientok s karcinómom mliečnej žľazy a korelovať výsledky s histopatologickými vlastnosťami nádoru.

Typ práce:
Prospektívna klinická štúdia.

Názov a sídlo pracoviska:
Ústav molekulovej biológie, Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Jesseniova lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Martin, Slovenská republika.

Metodika:
V súbore 95 pacientok s malígnym ochorením prsníka boli mutácie v exónoch 9 a 20 podrobené sekvenačnej analýze. Tiež sme sledovali asociácie medzi jednotlivými mutáciami a histologickými vlastnosťami nádoru.

Výsledky:
V tejto štúdii bol pozorovaný 25,3% (24/95) výskyt mutácií v PIK3CA géne, pričom boli pozorované rozdiely výskytu mutácií v helikálnej a kinázovej doméne (14,7 %, 10,5 %). Detekovali sme tri „hotspot“ mutácie, pričom dve sa nachádzajú v exóne 9 (E542K, E545K) a jedna v exóne 20 (H1047R). Vyšší výskyt mutácií v exóne 9 sme pozorovali u pacientok s nižším gradingom (p = 0,0074) a bez metastáz v axile(p = 0,0415). Mutácie v exóne 20 boli v našom súbore asociované s vyšším vekom pacientok (p = 0,0249). Mutácia E545K (exón 9) korelovala s nižším gradingom (p=0,0013) a pN stavom (p = 0,0232) a mutácia H1047R (exón 20) bola signifikantne častejšia v lobulárnom type (p = 0,0354) nádoru prsníka v porovnaní s duktálnym typom.

Záver:
V súčasnosti je aktuálnou otázkou význam najčastejších mutácií PIK3CA génu ako možného terapeutického cieľa pre toto ochorenie. Dokázali sme signifikantnú koreláciu medzi výskytom mutácií a niektorými histopatologickými vlastnosťami nádoru, ktoré naznačujú potenciálne priaznivé výsledky u pacientok s mutáciou v exóne 9.

Kľúčová slova:
„hotspot“ mutácie, PIK3CA, PI3K dráha, nádor prsníka

ÚVOD

Nádor prsníka, ako aj ostatné nádory, je charakterizovaný genetickou nestabilitou, ktorá vedie k somatickým zmenám v DNA rakovinových buniek. Tieto zmeny zahŕňajú genomické prestavby, ako amplifikácie a translokácie, a tiež ďalšie drobné zmeny, ktorých výsledkom sú mutácie v DNA sekvencii. Niektoré mutácie sú vhodnými potenciálnymi prognostickými markermi a tiež sú ideálnym cieľom terapie s dôrazom na rast a životaschopnosť rakovinových buniek [19]. Somatické mutácie v PIK3CA géne boli objavené v mnohých typoch ľudských nádorov (glioblastóm, nádor hrubého čreva, endometriálny karcinóm) s vysokou frekvenciou v nádore prsníka a kolorektálnom karcinóme [5].

Fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI3K) boli prvýkrát objavené pred viac ako 20 rokmi. Transformačná schopnosť virálnych onkoproteínov je závislá od asociácie s aktivitou PI3K kináz [13]. V ľudských nádoroch je častá deregulácia PI3K signálnej dráhy, preto sa v posledných rokoch vynaložilo veľké úsilie na vývoj inhibítorov PI3K dráhy na liečbu nádorov. Je však stále neznáme, ktoré nádory budú mať najväčší prospech z takejto liečby a ako najlepšie využiť takéto liečebné postupy. Okrem toho, možné nežiaduce biologické následky takejto terapie môžu limitovať potenciálny terapeutický účinok inhibície tejto dráhy [5]. Veľkým pokrokom bolo pochopenie, že PI3K hrá dôležitú úlohu v nádorovej iniciácii, progresii alebo udržiavaní nádoru. Nové liečebné postupy, ktoré sú zamerané na rozličné komponenty PI3K dráhy, preukazujú účinnosť v rôznych typoch ľudských nádorov v predklinických štúdiách a tieto liečivá sa začali používať v klinických štúdiách. Narastajúce predklinické dôkazy hovoria o tom, že niektoré typy nádorov môžu byť senzitívnejšie na terapiu namierenú len na jednu zložku PI3K dráhy. Patria sem napr. nádory s PIK3CA aktivujúcimi mutáciami, stratou PTEN, a nádory prsníka s HER2 amplifikáciou. Avšak je potrebné zistiť, či táto senzitivita nádorov bude demonštrovaná stabilným ochorením alebo zmenšením nádoru ako reakcia na terapiu zameranú len na jednu zložku. Naopak, zdá sa, že nádory s aktivujúcimi Ras mutáciami nie sú citlivé k inhibícii samotnej PI3K dráhy. V takýchto prípadoch môže byť účinná liečba pomocou PI3K inhibítorov a súbežne terapia zameraná na MAPK kinázovú signálnu dráhu [5].

PIK3CA mutácie sú prítomné približne v 25 % nádorov prsníka, čo zvyšuje atraktivitu tohto génu ako biomarkera prognózy a predikcie, ako bude pacientka odpovedať na terapiu. Treba zdôrazniť, že prognóza je odlišná od predikcie. Vo všeobecnosti, prognóza sa týka schopnosti biomarkera spoľahlivo posúdiť klinické výsledky, ako sú opätovný výskyt ochorenia alebo smrť. Na druhej strane, prediktor odpovede informuje lekára o pravdepodobnosti reakcie na liečbu pomocou vedomostí o vlastnostiach a správaní sa nádoru. Napríklad prognostickým faktorom u pacientov s nádorom prsníka sú pozitívne axilárne uzliny. Všeobecne, pozitivita uzlín, najmä postihnutie štyroch a viacerých uzlín, znamená horšiu prognózu v porovnaní s pacientkami bez postihnutia uzlín [20]. Amplifikácia HER2 je zase príkladom prediktívneho biomarkera, ktorá dokáže predpovedať senzitivitu k terapii zameranej na HER2, ako je trastuzumab a lapatinib. Treba poznamenať, že prediktívne markery nemusia byť nevyhnutne užitočné aj v prognóze. Napr. pozitivita estrogénového receptora alpha (ERα) je slabým prognostickým markerom pre zlepšenie dlhodobého prežívania, ale je relatívne silným markerom pre predpovedanie odpovede na endokrinnú terapiu [7, 19].

Potenciál PIK3CA mutácií ako prognostického biomarkera bol preskúmaný vo viacerých typoch nádorov. Avšak výsledky sú kontroverzné, niektoré štúdie naznačujú, že aktivujúce mutácie v PIK3CA géne by mohli byť priaznivým prognostickým markerom, kým iné štúdie dokázali koreláciu s horšími klinickými výsledkami. Úloha PIK3CA mutácií v nádore prsníka bola skúmaná v mnohých prácach, avšak výsledky sú stále nejasné. Zdá sa, že mutácie v helikálnej a kinázovej doméne majú rozdielne úlohy v prognóze [1, 15].

V našej štúdii sme sa zamerali na detekciu mutácií v exónoch 9 a 20 PIK3CA génu v parafínových rezoch pacientok s karcinómom prsnej žľazy. Rozhodli sme sa využiť kombináciu metód PCR amplifikácie a priamej sekvenácie DNA na detekciu mutácií a ich koreláciu vo vzťahu k histopatologickým a klinickým parametrom neoplastického ochorenia prsníka, ktoré následne môžu prispieť k skorej detekcii ochorenia, určeniu prognózy a stanoveniu cielenej liečby.

MATERIÁL A METODIKA

Klinické vzorky

Práca vznikla v spolupráci s Gynekologicko--pôrodníckou klinikou Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského a Univerzitnej nemocnice Martin, Ústavom patologickej anatómie Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského a Univerzitnej nemocnice Martin a Ústavom molekulovej biológie Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského, kde sa vykonávala kolekcia súboru pacientok s karcinómom mliečnej žľazy a boli vyšetrované zozbierané vzorky malígneho ochorenia z archívu, ktorý obsahuje všetky spádové a konzultačne vyšetrené biopsie karcinómu prsníka. V predkladanej práci sme analyzovali archivované parafínové rezy od 95 pacientok s potvrdeným karcinómom prsnej žľazy. Histopatologické parametre, vrátane stupňa diferenciácie (G), veľkosti nádoru, stavu lymfatických uzlín (pN), rozsahu nádoru (pT), stavu estrogénového receptora (ER), stavu progesterónového receptora (PR), a HER2 stavu sú uvedené v tab. 1. Priemerný vek pacientok bol 60 ± 12,7 rokov. Ďalšie klinické údaje, ako DFS a terapia, neboli k dispozícii.

DNA extrakcia

DNA bola z parafínových rezov izolovaná po deparafinizácii, pri ktorej dochádza k opakovanému rozpusteniu parafínu v xyléne s následnou inkubá-ciou parafínového rezu v zostupnej rade alkoholu. Na izoláciu DNA bol použitý DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Nemecko) podľa odporúčaní výrobcu.

Skríning mutácií

Genetická analýza PIK3CA génu prebiehala pomocou PCR amplifikácie exónov 9 a 20 s následnou dideoxysekvenáciou podľa Sangera. Štandardné podmienky PCR reakcií sme nastavili na celkový objem 25 μl. V každej reakcii sme použili 25 nM koncentrácie primerov, 200 μM deoxynukleotidtrifosfáty (dNTPs, Gene Amp dNTP Mix with dTTP, Applied Biosystems, USA), 2,5 mmol/L MgCl2 iónov, jednu jednotku Thermostart Taq polymerázy (FastStart Taq DNA Polymerase, Roche Diagnostics GmbH, Nemecko) a 1 μl templátovej DNA. Do každej PCR reakcie bola zaradená aj negatívna kontrola (voda). Pre oba exóny sme použili rovnaké podmienky PCR reakcie, ktorá prebehla v termálnom cykleri s nasledovným teplotným programom: 10 minút pri 95 °C, nasledovalo 45 cyklov s krokmi: denaturácia 30 sekúnd pri 90 °C, anelácia 1 minúta pri 60 °C a extenzia 1 minúta pri 72 °C. Finálna extenzia prebiehala 5 minút pri 72°C. V sekvenčnej reakcii boli použité tie isté primery ako v klasickej PCR reakcii; pre exón 9: forward, 5´-CAATGAATTAAGGGAAAATGACA-3´, reverse, 5´-TATTTATTCCAATAGGTATGGTA-3´; pre exón 20: forward, 5´-CCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAA-3´, reverse, 5´-TAACAGTGCAGTGTGGAATCCA-3´.

Získané sekvencie sme analyzovali v programe ChromasPro verzia 1.5 a porovnávali sme ich so sekvenciami v databáze BLAST (dostupné na internetovej stránke http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

VÝSLEDKY

Mutácie v géne PIK3CA sme identifikovali u 25,3 % (24/95) prípadov s potvrdeným nádorom mliečnej žľazy, pričom sme pozorovali rozdielny výskyt mutácií v exóne 9 (14,7 %) a v exóne 20 (10,5 %). V našom súbore sme objavili dve tzv. „hotspot“ mutácie v exóne 9 (E542K, E545K) a jednu v exóne 20 (H1047R). Na obrázku 1 sú zobrazené elektroferogramy s „hotspot“ mutáciami, ktoré sa nachádzajú v exóne 9 PIK3CA génu. Obrázok 2 zobrazuje „hotspot“ mutáciu v exóne 20. Tab. 2 uvádza prehľad mutácií v našom súbore.

Pozorovali sme asociácie medzi mutáciami a histopatologickými vlastnosťami nádoru. Výskyt mutácií v exóne 9 (E542K, E545K) bol signifikantne vyšší u pacientok s nižším gradingom (p = 0,0074) a bez metastáz v axile (p = 0,0415). Mutácie v exóne 20 (H1047R) boli v našom súbore asociované s vyšším vekom pacientok (p = 0,0249). Zistili sme aj korelácie medzi jednotlivými typmi mutácií s histopatologickými vlastnosťami ochorenia. Mutácia E545K (exón 9) korelovala s nižším gradingom(p = 0,0013) a pN stavom (p = 0,0232); mutácia H1047R (exón 20) bola signifikantne častejšia v lobulárnom type nádoru prsníka ako v duktálnom type(p = 0,0354).

DISKUSIA

PI3K patria do rodiny heterodimerických lipidových kináz, skladajúcich sa z p85-kDa (regulačnej) a 110-kDa (katalytickej) podjednotky [21], ktoré sú kódované odlišnými génmi a sú organizované do troch hlavných tried (trieda I, II a III) na základe ich štruktúry, substrátovej špecificity a regulácie. Fosforylujú fosfatidylinozitol, dôležitú zložku bunkových membrán a sekundárny mesenger zúčastňujúci sa bunkovej signalizácie [18]. Aktivované rôznymi tyrozín kinázovými receptormi, EGFR, ľudským EGFR2 (HER2), inzulínovým rastovým faktorom (IGF-1R) a rastovým faktorom odvodeným od krvných doštičiek (PDGFR) [3], PI3K sú dôležitými regulátormi rôznych bunkových procesov, ako bunkového rastu, transformácie, apoptózy, adhézie, prežívania a motility [2]. PIK3CA kóduje katalytickú podjednotku I. triedy PI3Kα kináz a je zodpovedný za fosforyláciu fosfatidylinozitol 4,5-bifosfátu (PIP2) na fosfatidylinozitol 4,5,6-trifosfát (PIP3) lokalizovanej na bunkovej membráne. Hoci boli v rôznych typoch nádorov objavené rôzne mutácie v PIK3CA géne, tri tzv. „hotspot“ mutácie, spôsobujúce zámenu jednej aminokyseliny, tvoria drvivú väčšinu všetkých PIK3CA mutácií. Dve z týchto „hotspot“ mutácií sa nachádzajú v exóne 9 v helikálnej doméne (E542K, E545K), tretia sa nachádza v exóne 20 v kinázovej doméne (H1047R). Štruktúrne a biochemické údaje naznačujú, že tieto mutácie fungujú cez rôzne mechanizmy: predpokladá sa, že mutácie v helikálnej doméne menia interakcie medzi p110α a p85 regulačnou podjednotkou, kým mutácie v kinázovej doméne spôsobujú zvýšenú afinitu k p110α substrátu, PIP2, a tiež menia interakcie s bunkovou membránou [9]. Všetky tri „hotspot“ mutácie vedú k aktivácii PI3K/AKT/mTOR dráhy a interagujú s komplexnou sieťou génov, vrátane mitogénom aktivovanej proteínovej kinázovej (MAPK) kaskády [19].

Prognostická hodnota PIK3CA mutácií v nádore prsníka je kontroverzná. Li a kol. naznačili, že mutácie v ktorejkoľvek časti génu môžu súvisieť so zlými klinickými výsledkami [14]. Naopak, Maruyama a kol. vo svojej práci informujú, že PIK3CA mutácie sú signifikantne a nezávisle asociované s lepším prežívaním pacientok [17]. Rôzne nezávislé štúdie pozorovali, že pacienti s mutáciou v kinázovej doméne (H1047R) majú lepšie prežívanie v porovnaní s pacientmi, ktorí danú mutáciu nemali [1, 15]. Barbareschi a kol. okrem toho vo svojej práci informovali o tom, že len mutácie v helikálnej doméne (exóne 9) PIK3CA génu, ktoré boli vo väčšej miere objavené v lobulárnom type karcinómu prsníka, boli nezávisle asociované so skorými recidívami a úmrtím, ale mutácie v exóne 20 boli asociované s priaznivými prognózami [1]. Naše výsledky naopak naznačujú priaznivejšie výsledky u pacientok s mutáciou v exóne 9. Dokázali sme signifikantne vyšší výskyt mutácií E542K a E545K (exón 9) v skupine pacientok s nižším gradingom a bez metastáz v axile. Ďalšia štúdia objavila, že všetky „hotspot“ mutácie v PIK3CA géne sú asociované s priaznivými výsledkami meranými celkovým prežívaním a špecifickým prežívaním pri ochorení, bez ohľadu na lokalizáciu nádoru, avšak mutácie v helikálnej a kinázovej doméne boli asociované s rôznymi pacientmi a rozdielnou nádorovou klasifikáciou [12]. V rozpore s týmito zisteniami iné štúdie prinášajú náhľad, že PIK3CA mutácie sú asociované s triple-negatívnymi nádormi prsníka [16] ako aj s inými nepriaznivými klinickými výsledkami [14].

Klinické dôsledky PIK3CA mutácií môžu varírovať v závislosti od stavu známych molekulárnych markerov v nádore prsníka, ako je ERα, progesterónový receptor (PR) a HER2. Cizkova a kol. vo svojej práci na 452 nádoroch prsníka potvrdili vysokú prevalenciu (33,4 %) PIK3CA mutácií. Frekvencia mutácií sa líšila v závislosti od ERα, PR a HER2 stavu, od 12,5 % v triple negatívnych nádoroch až po 41,1 % v HER+/HER2- skupine. Na základe ich analýz, sledujúcich prežívanie pacientok, identifikovali PIK3CA mutačný stav ako nezávislú prognostickú hodnotu u pacientok s HER2+ nádorom prsníka. Ich zistenia by mali byť potvrdené na väčšom počte pacientok v randomizovanej prospektívnej na HER2 založenej klinickej štúdii. Potom PIK3CA mutačný status môže slúžiť ako nový nezávislý prognostický nástroj pri selektívnej cielenej terapii pacientov s HER2+ nádorom prsníka [4]. V našej práci sme nedosiahli štatisticky signifikantné výsledky pri podobných analýzach sledujúcich výskyt mutácií v závislosti od ER, PR alebo HER2 stavu.

Cathomas vo svojej práci zozbieral údaje o výskyte PIK3CA mutácií v kolorektálnom karcinóme (CRC). Somatické mutácie v PIK3CA géne sú prítomné v 10–20 % všetkých CRC, mutácie sa nachádzajú hlavne v exóne 9 a 20. Zdá sa, že mutácie v PIK3CA ako samostatný prognostický marker majú veľmi malý vplyv na celkovú prognózu CRC, ale majú výrazný prediktívny vplyv na anti-EGFR terapiu v Ras wild-type nádoroch. Navyše existuje silný dôkaz o prediktívnej hodnote PIK3CA mutácií pri adjuvantnej terapii použitím aspirínu, avšak je potrebné definitívne definovať vplyv, najmä v konkrétnom exóne, PIK3CA mutácií na manažment pacientov s CRC [3].

Pokroky v poznaní nádorovej biológie a mechanizmu onkogenézy umožnili identifikovať viaceré molekulárne ciele využiteľné v liečbe nádorových ochorení. Molekulárne ciele zohrávajú významnú úlohu v tumorovom raste a progresii. Sú prítomné v zdravom tkanive, ale môžu byť prítomné vo zvýšenej expresii v nádoroch. Cielená liečba na rozdiel od konvenčnej chemoterapie pôsobí priamo na špecifické molekuly nádorovej bunky a signálne dráhy, čím sa dosahuje vyšší účinok a nižšia toxicita [8]. U pacientov s nádorom prsníka s mutáciou v PIK3CA géne bola pozorovaná lepšia odpoveď na kombinovanú terapiu [10], čo je v súlade s predklinickými údajmi naznačujúcimi, že terapia zameraná na inhibíciu len jednej zložky PI3K/AKT/mTOR dráhy nemusí byť vždy dostatočná na vyvolanie odpovede, pretože PIK3CA mutácie často koexistujú s ďalšími molekulárnymi aberáciami [6]. Tieto výsledky sú dôležité pri ďalšom vývoji inhibítorov PI3K signálnej dráhy. Je potrebné urobiť analýzy na väčšom súbore pacientov a tiež sa zamerať na hlbšiu analýzu ďalších molekulárnych markerov, ktoré by tiež mohli ovplyvňovať celkovú odpoveď na terapiu [11].

Cielená liečba inhibuje proliferáciu nádorových buniek ovplyvnením špecifických molekúl potrebných pre rast a proliferáciu buniek. Zavedenie do klinickej praxe by mohlo priniesť ekonomický benefit a zlepšenie prežívania pacientov. Avšak cielená liečba môže mať aj určité limity, ako vývoj rezistencie, prípadne strata liečebnej odpovede. S použitím cielenej liečby sa otvorili i nové otázky o biológii nádorového tkaniva a možnostiach individualizácie protinádorovej liečby.

ZÁVER

V našej štúdii sme zistili frekvenciu výskytu PIK3CA mutácií v populácii slovenských žien s karcinómom prsníka, ktorá je porovnateľná s publikovanými prácami. Dokázali sme najčastejšie sa vyskytujúce mutácie v exóne 9 (E542K, E545K) a exóne 20 (H1047R). Tiež sa nám podarilo dokázať signifikantnú koreláciu medzi výskytom mutácií a niektorými histopatologickými vlastnosťami nádoru, ktoré naznačujú potenciálne priaznivé výsledky u pacientiek s mutáciou v exóne 9, čo bude treba potvrdiť resp. vyvrátiť na väčšom súbore pacientiek a na jednotlivých histologických subtypoch karcinómov prsníka.

Práca bola podporená grantom UK/89/2013, VEGA MŠ 1/0243/12 a VEGA MŠ 1/0333/12.

Mgr. Andrea Mendelová

Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a UNM

Kollárova 2

036 59 Martin

Slovenská republika

e-mail: a.mendelova@gmail.com