Inaktivace genů BRCA1, BRCA2 a p53 u sporadického karcinomu vaječníků

Souhrn

Cíl studie:
Analýza četnosti a způsobu inaktivace tumorsupresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53 u sporadického epiteliálního karcinomu vaječníků.

Typ studie:
Původní práce.

Název a sídlo pracoviště:
Onkogynekologické centrum, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha.

Materiál a metodika:
Analýza ztráty heterozygozity (LOH), ztráty exprese a přítomnosti somatických mutací byla zpracována na templátu genomické DNA a celkové buněčné RNA získaných z čerstvě zmražených nádorů a periferní krve.

Výsledky:
LOH v alespoň jedné oblasti byl nalezen u 60 % nádorů. Většina alterací se nevyskytovala solitárně, ale ve spojení s delecí dalších oblastí.

Závěr:
Naše studie potvrdila vysokou četnost somatických alterací genů BRCA1 a BRCA2 u sporadického epiteliálního karcinomu vaječníků.

Klíčová slova:
BRCA1, BRCA2, p53, karcinom vaječníků, LOH.

ÚVOD

Naše znalosti o roli genů BRCA1 a 2 (BReast CAncer genes 1 and 2) u hereditárního karcinomu prsu a vaječníků se velmi rychle rozšiřují [16, 17]. Stále však víme velmi málo o jejich úloze v procesu vzniku a rozvoje sporadického karcinomu prsu, a především vaječníků.

Frekvence alelických ztrát genu BRCA1 u epiteliálního ovariálního karcinomu je uváděna v rozmezí 23–44 procenta, genu BRCA2 pak 25–40 % [4, 5, 7, 11]. Somatické mutace genů BRCA1 a 2 jsou extrémně vzácné. Je zajímavé, že pokud jsou nalezeny, pak u karcinomu z jasných buněk [7, 14]. Dalším možným mechanismem somatické inaktivace těchto tumorsupresorových genů je hypermetylace promotorových sekvencí [3, 12], a tím potlačení exprese. V úvahu přicházejí i velké genomické přestavby (gross genomic rearrangements), dosud sice popisované vzácně, nicméně teoreticky považované za poměrně časté události při amitotickém dělení nádorových buněk [13, 17].

Výpadek funkce genu BRCA1 je spojován s horší odpovědí na léčbu taxany. Teoretické vysvětlení tkví v odpovědnosti proteinového produktu tohoto genu za rozpoznání poruchy mitotického vřeténka a spuštění procesu apoptózy.

Alterace genu p53 jsou časnou událostí v ovariální karcinogenezi [10]. Mutace a/nebo overexprese p53 byly detekovány ve 26–62 % nádorů [2]. Univariantní analýza ukázala v několika studiích vztah mezi overexpresí a horším přežitím u pacientek s ovariálním karcinomem, zdá se však, že nebude nezávislým markerem špatné prognózy [6].

V naší práci jsme studovali frekvenci a způsob inaktivace genů BRCA1, BRCA2 a p53 ve skupině 30 vzorků sporadického karcinomu vaječníků. Analyzovali jsme ztrátu heterozygozity (loss of heterozygosity – LOH), přítomnost somatických mutací a ztrátu exprese.

METODIKA

Nádorová tkáň

U pacientek operovaných na Gynekologicko-porodnické klinice 1. LF UK a VFN pro diagnózu epiteliálního karcinomu ovaria byla přímo na operačním sále nebo při vyšetření peroperační histologie odebrána částka asi 1 x 1 x 1 cm z velmi suspektního místa odebraného nádoru. Částka byla bezprostředně po odběru zmražena v tekutém dusíku a skladována v hlubokomrazícím boxu při teplotě –80 °C. Z každého odebraného vzorku nádoru byly standardním postupem připraveny dva histologické řezy. Po obarvení hematoxylinem-eozinem odečetl patolog podíl nádorových buněk ve vyšetřovaném vzorku. Pro analýzu byly použity pouze nádory, v nichž bylo zastoupení nádorových buněk větší než 50 %.

Každé pacientce bylo současně odebráno 7 ml periferní žilní krve do zkumavky s EDTA. Tento vzorek sloužil k izolaci DNA a RNA.

Všechny vyšetřované pacientky daly písemný informovaný souhlas s genetickým vyšetřením a byly poučeny o možnosti odhalení hereditární dispozice a o důsledcích tohoto nálezu. Protokol vyšetření i text informovaného souhlasu byly schváleny Etickou komisí 1. lékařské fakulty University Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice.

Histopatologické charakteristiky analyzovaných nádorů jsou uvedeny v tabulce 1. Většina pacientek (21/30 – 70 %) byla diagnostikována ve stadiu III podle FIGO. Téměř identicky byla zastoupena stadia I a IV (4/30 – 13,3%; 5/30 – 16,7 %), stadium II nebylo reprezentováno žádnou pacientkou.

Izolace DNA a RNA z plné periferní krve a tkáně tumoru

Nukleové kyseliny byly izolovány komerčními kity dle instrukcí výrobce, jak již bylo dříve popsáno [16]. Jako referenční DNA byla použita DNA z nenádorové tkáně, celková RNA byla přepsána do cDNA (complementary DNA) a použita k části mutační analýzy genů BRCA1 a 2.

Mikrosatelitární markery

Jako mikrosatelitární markery (také STRs – short tandem repeats) jsou označovány úseky DNA, v nichž se opakovaně tandemově za sebou vyskytuje jedno- až šestibázový motiv. Celková délka takové sekvence je do několika set párů bází. Jsou velmi frekventní, jeden mikrosatelitární marker připadá na 6 kb genomické sekvence. Pro svou vysokou heterozygozitu jsou využívány v mnoha aplikacích, včetně forenzních.

V naší studii jsme použili mikrosatelitové markery pro analýzu ztráty heterozygozity. Jako informativní byl označen marker, pro nějž byla pacientka heterozygotní. Ztráta heterozygozity (LOH – loss of heterozygosity) v nádoru byla posuzována vzájemným srovnáním intenzity alel ve zdravé a nádorové tkáni podle vzorce (At x Bn)/(Bt x An). LOH byl přítomen, pokud byla intenzita předpokládané deletované alely snížena na méně než 50 % (posuzováno podle jednotlivých metod – vizuálně, nebo podle plochy pod křivkou).

Amplifikace mikrosatelitárních markerů

K analýze byly pro oblast každého z genů BRCA1/2 zvoleny tři mikrosatelitové markery, pro oblast genu p53 markery dva. Všechny markery pro gen BRCA1 a jeden marker pro gen p53 byly intragenové, jeden marker pro gen p53 a tři markery pro gen BRCA2 hraničící (flanking). Vzdálenost markeru D13S169 od začátku kódující sekvence genu BRCA2 (up-stream) byla 284,5 kb, a markerů D13S1699 a D13S1701 od konce kódující sekvence genu BRCA2 (down-stream) 550 kb a 171 kb, vzdálenost markeru TP02 od konce kódující sekvence genu p53 byla 27 kb. Dostupné markery byly nalezeny pomocí databází The Genom Database (http://www.gdb.org) a LocusLink (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Amplifikace byla provedena pomocí standardní PCR [8]. Použité primery a délku amplikonu uvádí tabulka 2.

Polyakrylamidová elektroforéza s přídavkem polymeru Spreadex Polymer NAB

Amplifikované fragmenty byly rozděleny horizontální polyakrylamidovou elektroforézou. K akrylamidu byl přidán Spreadex Polymer NAB (Elchrom Scientific, USA) obsahující speciální monomer a síťovací činidlo. Spreadexové gely získávají vysokou rozlišovací schopnost i na krátkých vzdálenostech, což umožňuje separaci fragmentů lišících se pouze o 2 báze na krátkých gelech. 2 – 3 μl PCR produktu byly smíchány s 1 μl nanášecího pufru obsahujícího z 50 % glycerol, 0,05 % bromfenolovou modř a 0,05 % xylencyanol ve standardním TAE pufru. Vzorky byla rozděleny na 5 cm dlouhém nedenaturujícím gelu, acrylamid:bisakrylamid 29:1, obsahujícím 10 % Spreadex Polymer NAB. Pro zabránění nerovnoměrné polymerace gelu při styku s hřebenem byl použit 1 cm dlouhý 4%, tzv. ostřící gel. Elektroforéza probíhala ve standardním TAE pufru při laboratorní teplotě za konstantního napětí 200 V v aparatuře MiniProtean (Bio-Rad Laboratoires, USA). Gely byly 20 min barveny v roztoku SYBR Green (1 : 10000) v TAE pufru a fotografovány. Podle délky mikrosatelitového markeru byla zvolena vhodná koncentrace akrylamidu v gelu a délka (čas) elektroforézy. Ztráta heterozygozity byla hodnocena subjektivně dvěma nezávislými pozorovateli jako snížení intenzity signálu o více než 50 %. Jako velikostní standard byl použit M3 Marker (Elchrom Scientific, USA), získaný digescí pBR322 třemi restrikčními enzymy, MspI, HhaI a HaeIII. Tato metodika byla vyvinuta na Ústavu biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK [8].

VÝSLEDKY

Analýza byla provedena ve třech tumorsupresorových genech – BRCA1, BRCA2 a p53 – za použití intragenových a sousedících (flanking) mikrosatelitových markerů.

Jako informativní byl hodnocen marker, pro nějž byla příslušná pacientka heterozygotní, jako neinformativní pak marker, který byl u pacientky homozygotní. Celková heterozygozita (informativnost) se pohybovala mezi 90,0 % a 96,7 %. V markerech pro alelickou ztrátu v oblasti genu BRCA1 a p53 nebyla informativní jediná pacientka (3,3 %), v oblasti BRCA2 tři pacientky (10 %).

Ztráta heterozygozity v oblasti genu BRCA1 byla nalezena u 11 nádorů (37,9 %). Histologické typy nádorů, kromě endometroidního karcinomu, jsou v této skupině zastoupeny rovnoměrně: sérózní karcinom – 4 (36,4 %), mucinózní karcinom – 3 (27,2 %), nediferencovaný karcinom – 4 (36,4 %).

V oblasti genu BRCA2 byla ztráta heterozygozity přítomna u 10 nádorů (37,0 %), z toho u 2 serózních karcinomů (20,0 %), 4 mucinózních karcinomů (40,0 %), 3 nediferencovaných karcinomů (30,0 %) a jednoho endometroidního karcinomu (10,0 %).

Ve více než polovině analyzovaných nádorů byla zachycena ztráta heterozygozity v oblasti genu p53 – 16 nádorů (55,1 %). Zastoupení tří hlavních histologických typů je zde rovnoměrné. Serózní karcinom – 6 (37,4 %), mucinózní karcinom – 5 (31,3 %), nediferencovaný karcinom – 5 (31,3 %). Endometroidní karcinom nebyl v této skupině zastoupen (tab. 3).

Ztráta heterozygozity (LOH) v některé z analyzovaných oblastí byla zachycena u 18 nádorů (60,0 %). U pěti z těchto nádorů byl LOH identifikován pouze v úseku jednoho z genů (27,8 %). Třikrát v oblasti genu p53 (16,7 %) a dvakrát v oblasti genu BRCA2 (11,1 %). V oblasti genu BRCA2 byl pozorován LOH i ve spojení se ztrátou heterozygozity v oblasti genu p53 (2 případy – 11,1 %). Ztráta heterozygozity v oblasti genu BRCA1 nebyla nikdy pozorována izolovaně, vždy pouze ve spojení s LOH v oblasti p53 (5 případů – 27,8 %) nebo p53 i BRCA2 (6 případů – 33,3 %), ne však ve spojení s LOH pouze v oblasti BRCA2. Uvedené podíly se vždy vztahují ke skupině nádorů s LOH (tab. 4).

Ve všech analyzovaných nádorech byla vyšetřována exprese genů BRCA1 a BRCA2 metodou RT-PCR (reverse transcription PCR). Exprese genu BRCA1 nebyla přítomna u dvou nádorů z vyšetřovaného souboru (6,7 %), exprese genu BRCA2 chyběla u jednoho vzorku (3,3 %). Nádor, v němž se nepodařilo zachytit expresi genu BRCA2, byl heterozygotní pro všechny sledované mikrosatelitní markery a nebyla v něm detekována ztráta heterozygozity. Jeden z nádorů s chybějící expresí genu BRCA1 také nevykazoval ztrátu heterozygozity, ve druhém byla naopak potvrzen výpadek alely na základě analýzy všech tří mikrosatelitových markerů.

U nádorů se ztrátou heterozygozity v oblastech genů BRCA1 a BRCA2 byla provedena mutační analýza s cílem odhalit případné somatické mutace. Analýza proběhla standardními metodami používanými naší laboratoří k detekci hereditárních mutací. Nebyla však nalezena žádná somatická mutace těchto genů.

DISKUSE

Karcinom vaječníků je jednou z nejagresivnějších gynekologických malignit. Je to nádor chemosenzitivní, avšak ne chemokurabilní. Chemoterapie má ale v jeho managementu nezastupitelnou roli.

Tři čtvrtiny epiteliálních ovariálních karcinomů zachytíme v pokročilém stadiu s peritoneálním rozsevem. Typická je pro ně častá rekurence a vývoj chemorezistence. Tu můžeme rozdělit do dvou skupin: de novo rezistence a získaná rezistence. Přibližně 20 % pokročilých ovariálních karcinomů primárně neodpovídá na podanou chemoterapii – hovoříme pak o de novo rezistenci narozdíl od skupiny nádorů, u nichž dochází k postupné selekci rezistentních klonů, a tedy získané chemorezistenci.

Výzkumná pozornost je zaměřena na identifikaci pacientek, u nichž lze očekávat rozvoj rezistence, a na identifikaci nových terapeutických přístupů, které budou založeny na biologických charakteristikách daného primárního nebo rekurentního nádoru a budou do značné míry personalizované.

Jednotlivé histologické typy epiteliálního ovariálního karcinomu vznikají za účasti odlišných genetických změn. Největší pozornost je soustředěna na predikci rezistence vůči platinovým derivátům a taxanům jako základním látkám užívaným v adjuvantní a neadjuvantní chemoterapii u karcinomu ovarií. Mnoho prací se věnuje prediktivnímu významu inaktivace genu p53, jehož produkt je klíčový pro kontrolu buněčného cyklu a spuštění apoptózy, a dochází k různým závěrům. V současné době se zdá, že inaktivace p53 může sloužit jako prediktivní faktor pouze ve spojení s dalšími genetickými defekty, kdy až následně výpadek funkce proteinu p53 znamená sníženou senzitivitu k platinovým derivátům (např. mutace genu PTEN). Důležitějším samostatným prediktorem se v současné době jeví být výpadek proapoptotického genu Bax nebo nadměrná exprese protiapoptotického genu (v současné době probíhají klinické studie fáze II a III s antisense oligonukleotidem k Bcl-2 – oblimersenem).

Molekulárním argumentem pro kombinaci taxanů s platinovými deriváty je zprostředkování apoptózy kaskádou spouštěnou proteinem Bax nezávisle na p53. Rezistence k platinovým derivátům se však může i časně kombinovat s rezistencí k taxanům. Ze studií u žen s hereditární mutací genu BRCA1 máme informaci, že karcinomy prsu u těchto žen vykazují nižší míru odpovědi na terapii taxany ve srovnání se skupinou pacientek bez mutace. Jak dokládá naše studie, podobně vzniká rezistence i u karcinomu ovariálního.

Zdá se, že v blízké budoucnosti bude molekulární analýza primárního nádoru nebo recidivujících tumorů užitečným nástrojem pro predikci (a případní nastavení) terapeutické odpovědi. Zároveň přinese i využití biologicky orientované léčby se zaměřením na kaskády ovlivňující proces chemorezistence (antisense oligonukleotidy, inhibitory proteinkináz).

ZÁVĚR

Výzkum úlohy genů BRCA1 a 2 u sporadického karcinomu vaječníků teprve začíná. Naše studie potvrzuje, že defekt těchto genů je významnou a častou událostí v ovariálním epiteliálním karcinomu. Důležitá bude pro budoucnost především analýza vztahu těchto alterací k biologickým vlastnostem nádorů a jejich odpovědi na léčbu.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR/9051-3.

MUDr. Michal Zikán, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: michal.zikan@lf1.cuni.cz