Aspekty výběru embryí a jejich příprava pro vznik lidských embryonálních kmenových buněk určených k humánní terapii

Souhrn

Cíl práce: Práce se zabývá klinickou částí výzkumu lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Cílem projektu je vznik somatických buněčných typů použitelných ve vývoji léčiv, regenerativní medicíně a buněčné terapii. Výhledem je umožnit cílenou terapii dosud nevyléčitelné nemoci. Pluripotentní hESC mají neomezenou kapacitu pro sebeobnovu. Této vlastnosti se využívá v terapii, kdy jsou z hESC vytvořeny chybějící nebo poškozené buňky v lidském těle. Je zájem vytvořit hESC linie v klinické kvalitě, použitelné v předklinických a klinických studiích.

Metodika: Vytvoření hESC musí respektovat legislativu ČR a EU. Podmínkou bylo vypracovat informovaný souhlas obou dárců pro darovaná vyřazená embrya, která nejsou vhodná pro léčbu oplodněním in vitro dle směrnice 2004/23/ES. Centrum asistované reprodukce (CAR) FN Brno se podílí na odběru oocytů, kultivaci a kryokonzervaci embryí, komunikaci s klienty a zajišťování informovaných souhlasů dárců embryí. Byl vypracován předávací protokol a metodika předávání rozmrazených embryí s originálním číselným kódem. Před předáním embryí na spoluautorské pracoviště – Centrum buněčného a tkáňového inženýrství (CTEF) ICRC FN u sv. Anny – je provedeno jejich rozmrazení, v případě potřeby dokultivování do stadia blastocysty, a následně je proveden asistovaný hatching.

Výsledky: V období leden 2018 až červenec 2020 bylo obesláno 138 vybraných vhodných klientek na dárcovství, z nichž 52 nereagovalo, 19 ukončilo a 29 prodloužilo skladování embryí. Pouze 38 klientek, tj. 27,5 %, souhlasilo s jejich využitím na přípravu hESC. Ve stejném období probíhala osobní komunikace s vhodnými klienty CAR a bylo získáno dalších 17 dárců embryí. Celkem bylo získáno 160 embryí od 55 dárkyň ve věku 26–42 let. Nejčastěji byla embrya zamrazena ve stadiu blastocysty (53 embrií – 33,1 %) a moruly (74 embrií – 46,3 %). Z 29 geneticky vyšetřených embryí je 5 euploidních (17,2 %), 2 mozaiky a 22 aneuploidních nebo s translokací či přenašečů s monogenní vadou.

Závěr: Byl vypracován a Etickou komisí LF MU a FN Brno schválen informovaný souhlas, bylo vybráno a zajištěno 160 darovaných embryí. Je vypracován předávací protokol a metodika předávání. Plán předávání rozmrazených anonymizovaných embryí zahrnuje cca 5 rozmrazených blastocyst týdně s provedeným asistovaným hatchingem. Po předání embryí na CTEF probíhá izolace embryoblastu s následnou kultivací. Ustanovené buněčné linie hESC musí splnit specifikovaná kritéria bezpečnosti, stability a pluripotence. Věříme, že v souladu s plánem projektu získáme nejméně tři linie hESC v klinické kvalitě, poprvé vytvořené v ČR, respektující požadavky na léčivé přípravky Advanced Medicinal Therapy Products (AMTP).

Klíčová slova:

výběr embryí – IVF – dárcovství – blastocysta – vitrifikace – embryoblast – lidské embryonální kmenové buňky – buněčná terapie

Úvod

Práce se zabývá klinickou částí výzkumu lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Cílem celého projektu je vznik somatických buněčných typů použitelných ve vývoji léčiv, regenerativní medicíně a buněčné terapii. Výhledem je umožnit cílenou terapii dosud nevyléčitelné nemoci, např. diabetes mellitus, poranění míchy či Parkinsonovy choroby.

Pluripotentní hESC mají neomezenou kapacitu pro sebeobnovu. Této vlastnosti se využívá v terapii, kdy jsou z hESC vytvořeny chybějící nebo poškozené buňky v lidském těle. Je zájem vytvořit hESC linie v klinické kvalitě použitelné v předklinických a klinických studiích, jak jsme uváděli v našich předchozích publikacích [1,2].

Úkolem klinické části projektu je výběr a zajištění dostatečného počtu darovaných embryí. Vědeckovýzkumná činnost využívající lidská embrya je upravena zákony č. 227/2006 Sb., o výzkumu na lidských embryonálních buňkách, a č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách [3,4].

Metodika izolace a kultivace hESC podléhá přísným regulím Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT ČR) a její schválení bylo podmínkou řešení našeho projektu. Podmínkou úspěšné realizace projektu je mezioborový tým zvládající lékařské, technologické a instrumentální postupy a protokoly, nezbytné pro navrhovaný výzkum.

Materiál a metodika

Vytvoření hESC musí respektovat legislativu ČR a EU. Podmínkou bylo vypracovat informovaný souhlas obou dárců pro darovaná vyřazená embrya, která nejsou vhodná pro léčbu oplodněním in vitro dle směrnice 2004/23/ES. Centrum asistované reprodukce (CAR) FN Brno se podílí na odběru oocytů, kultivaci a kryokonzervaci embryí, komunikaci s klienty a zajišťování informovaných souhlasů dárců embryí.

Byl vypracován předávací protokol a metodika předávání rozmrazených embryí s originálním číselným kódem. Před předáním embryí na spoluautorské pracoviště Centrum buněčného a tkáňového inženýrství (CTEF) ICRC FN u sv. Anny je provedeno jejich rozmrazení, v případě potřeby kultivace do stadia blastocysty, a následně byl proveden asistovaný hatching pomocí laseru [5].

Aspekty výběru embryí

Anabáze výběru embryí začala procházením protokolů laboratoře CAR s kryokonzervacemi embryí. Byla nutná kon­trola adres klientů, včetně jejich poměrně složitého dohledávání, úhrady skladování, stávajícího počtu a stadia embryí. Vytvořená základní databáze potenciálních dárců zahrnovala kontaktní údaje pacientů, věk, datum zamrazení, počet a stadium embryí, počet embryí v jedné pejetě a informaci o genetickém vyšetření.

Vytvoření informovaného souhlasu vyžadovalo spolupráci s právníkem a schválení Etickou komisí komisí LF MU a FN Brno. Poté byla připravena česká a anglická verze. Připravený dopis se základními informacemi a požadavkem na vyjádření jak naložit s kryokonzervovanými embryi byl rozeslán spolu se zpáteční obálkou. Následná komunikace probíhala pomocí telefonátů, e-mailů, dopisů a osobních jednání.

Na základě zákona č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách, je možné s embryi naložit takto:

1. uchovat pro další použití u příjemkyně, tzn. prodloužit skladování embryí na základě žádosti obou partnerů;
2. udělit souhlas s jejich využitím pro výzkum na lidských embryonálních kmenových buňkách;
3. udělit písemný souhlas s likvidací embryí. Na základě souhlasu jsou embrya následně rozmrazena a zlikvidována [4].

Příprava embryí

Embrya určená na stanovený termín předání do CTEF rozmrazujeme pomocí médií Warm Cleave (Vitrolife, Švédsko) či Warm Blast (Vitrolife, Švédsko) dle zamrazených stadií [6].

U nižších stadií embryí provádíme dokultivování do stadia blastocysty v médiu (Blastocyst Medium, COOK) v prostorách embryologické laboratoře CAR FN Brno. Po dosažení blastocysty je pomocí laseru (OCTAX NaviLase) proveden asistovaný hatching (obr. 1a–c).

Předání embryí a izolace embryoblastu na CTEF

Připravená embrya ve stadiu hatchující blastocysty jsou přenesena do transportního média a pomocí transportního inkubátoru s regulovanou teplotou na 37 °C (inkubátor přenosný ICT-P, výrobce Falc) jsou převezeny do laboratoře CTEF. Bezprostředně poté zde probíhá izolace embryoblastu s následnou kultivací buněčné linie hESC [2].

Embryoblast je izolován mechanicky s použitím mikroskopu (Nikon Eclipse Ti) s připojenými mikromanipulátory (Eppendorf), olejovým a vzduchovým mikroinjektorem (CellTram® 4r Air/Oil). Blastocysta je před izolací embryoblastu umístěna do média (Sydney IVF Gamete Buffer, výrobce COOK) pokrytého kultivačním olejem (Sydney IVF Culture Oil, výrobce COOK) pomocí denudačních mikropipet (Microtech IVF). Pro následnou izolaci je použita bio­ptická a fixační mikropipeta (Microtech IVF). Každý embryoblast je izolován samostatně, sterilně a jsou vedeny podrobné záznamy popisující derivaci a všechny následné kroky výroby [7].

Výroba hESC

Výroba je prováděna v čistých prostorách oddělení CTEF ve třídě čistoty A na pozadí třídy čistoty B dle současné správné výrobní praxe. Jsou popsány standardními operačními postupy, je prováděn mikrobio­logický a částicový monitoring. Každá linie je vedena jako samostatná šarže, která je v průběhu výroby i jako finální produkt hodnocena pracovníky kontroly kvality na sterilitu, kvalitu, bezpečnost a další kritické parametry. Každému finálnímu produktu, tj. linii hESC v klinické kvalitě, je vytvořen analytický certifikát.

Výsledky

V období leden 2018 až červenec 2020 bylo obesláno 138 vybraných vhodných klientek na dárcovství, které měly zamrazena embrya v letech 2014–2017. Z toho 52 žen (37,7 %) nereagovalo na dopis, 19 (13,8 %) ukončilo a 29 pacientek (21,0 %) prodloužilo skladování embryí (tab. 1). Pouze 38 párů, tj. 27,5 %, souhlasilo s jejich využitím na přípravu hESC (obr. 2).

Ve stejném období probíhala osobní komunikace s vhodnými klienty CAR. Z 22 osobně oslovených párů na CAR, které měly zamrazena embrya v období leden 2018 až červenec 2020, bylo získáno dalších 17 dárců embryí (77,3 %). Výrazně vyšší podíl dárců z přímo oslovených klientů proti souboru obeslaných žen (27,5 %) byl zjevně ovlivněn osobním projednáním u vybrané skupiny párů – zejména u případů s geneticky vyšetřenými embryi nevhodnými na transfer (6 párů, tj. 27,3 %). Zbývající část oslovených se rekrutovala z klientů, kteří neuvažovali o kryokonzervaci všech embryí (6 párů, tj. 27,3 %) nebo ji chtěli ukončit (10 párů, tj. 45,4 %). Nezanedbatelný vliv může mít i časový odstup, situace ve společnosti a vývoj názoru na potřebu medicínského výzkumu. Z osobní komunikace s 22 páry byla ukončena kryokonzervace v 5 případech (22,7 %) rozmrazením a likvidací embryí.

Celkem bylo získáno 160 embryí od 55 dárců ve věku 26–42 let. Nejčastěji byla embrya zamrazena ve stadiu moruly (74 embryí, tj. 46,3 %) a blastocysty (53 embryí, tj. 33,1 %). Skladba stadií embryí je uvedena v tab. 2. Počet zamrazených embryí v pejetě byl 1 nebo 2 embrya a respektoval požadavek pacientky. Náš doporučovaný standard je 1 embryo/pejeta a v našem souboru činil 61,2 % embryí (98 pejet). Dále bylo 62 (38,8 %) embryí zamrazeno po dvou v pejetě   (31 pejet).

Z 29 geneticky vyšetřených embryí je 5 euploidních (17,2 %), 2 mozaiky (7,9 %), 16 aneuploidních (55,2 %) a 6 embryí s translokací či přenašečů s monogenní vadou (20,7 %) (tab. 3). Poměrně malý počet geneticky vyšetřených embryí z celého souboru (18,1 %) je dán převážným složením ze zdravých embryí. I tak je tento podíl vyšší než průměr na našem pracovišti.

V období listopad až prosinec 2020 bylo zahájeno předávání rozmrazených dokultivovaných životaschopných blastocyst s provedeným asistovaným hatchingem do CTEF. Z celkem 12 rozmrazených embryí od 6 dárkyň bylo ve 2 dávkách předáno 9 blastocyst (75,0 %). Po převzetí embryí proběhla v laboratoři CTEF mechanická izolace embryoblastu a následná kultivace buněčné linie hESC.

Diskuze

Podmínkou úspěšné realizace našeho projektu bylo vytvoření plně operativního týmu pokrývajícího lékařské, technologické a instrumentální aspekty, které jsou nezbytné pro navrhovaný výzkum a vývoj. Patří mezi ně:

1. prokázané odborné znalosti v derivaci hESC;
2. přímý přístup do zařízení cGMP s odpovídající odborností ve vývoji lékařské aplikace ATMP;
3. zapojení CAR s odbornými znalostmi v oblasti manipulace s lidskými embryi a přístupu k potenciálním dárcům [1,8].

Zákon 227/2006 Sb., o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách (hESC):

• umožňuje jen výzkum prováděný na liniích hESC (§2a);
• liniemi hESC jsou všechny hESC, které jsou uchovávané v kulturách nebo jsou v návaznosti na ně skladovány v kryokonzervované formě (§2c);
• hESC jsou všechny pluripotentní kmenové buňky pocházející z lidských preimplantačních embryí vytvořených mimotělně (§2b);
• lze použít jen embrya, která nejsou starší než 7 dní (bez doby kryokonzervace) (§ 8/3).

Úmluva o lidských právech a bio­medicíně (Výzkum na embryích in vitro: čl. 18/1 „Pokud zákon umožňuje provádět výzkum na embryích in vitro, musí být zákonem zajištěna odpovídající ochrana embrya.“) nerozlišuje mezi embryem a hESC, požaduje pouze zákonnou ochranu embrya při povoleném výzkumu. Důvodová zpráva k zákonu o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách uvádí, že „návrh zákona se netýká výzkumu na embryích, ale výzkumu pouze na lidských embryonálních kmenových buňkách, je v souladu s principy Úmluvy o lidských právech  a bio­medicíně“ [4].

Problematikou rozmrazování embryí v rozdílných kultivačních podmínkách dle zamrazených stadií jsme se zabývali v našich předchozích studiích [6,9]. Pro moruly využíváme dle doporučení výrobce médium Warm Cleave a pro rozmrazení blastocyst médium Warm Blast. Již v roce 2007 se problematikou metabolizmu lidských embryí po kryokonzervaci zabývali Stokes et al [10].

Nejstarší embrya vhodná k dárcovství pro základní výzkum máme z roku 1997. Problémem je, že u většiny dárců z tohoto období je přerušena komunikace s CAR a na skladování embryí nehradí. Dosud však nebyly dořešeny všechny etické aspekty a u těchto embryí nebylo Etickou komisí FN Brno schváleno ukončení skladování.

Na zaslanou výzvu nereagovalo téměř 38 % respondentů, u části obeslaných (7 %) bylo nutno znovu dohledat či telefonicky zjistit aktuální adresu. Téměř 20 % klientů reagovalo na dopis pozitivně, o embrya nechtěli přijít a chtěli domluvit termín transferu. Poměrně velká část obeslaných (14 %) chtěla ukončit skladování bez účasti ve výzkumném projektu. U ně­kte­rých párů tato informace vyvolala rozporuplné reakce a názorové střety mezi partnery, pro kterou variantu se rozhodnout.

Při osobní komunikaci byly zmiňovány tři nejvýznamnější důvody pro darování embryí pro výzkumné účely. První byl názor, že je vhodnější používat embrya k výzkumu, než je ničit nebo jimi plýtvat. Řada respondentů byla pozitivně nakloněna a učinila pozitivní obecná prohlášení o výzkumu. Třetím důvodem byl altruizmus vyjádřený jako touha pomáhat jiným neplodným párům a rozvíjet vědecké a lékařské znalosti.

Důvodů k odmítnutí využití embryí pro výzkumné účely je mnoho. Nejčastější je pohled na embryo jako na potenciální dítě. Někteří pacienti silně emocionálně prožívali představu darování embryí pro lékařský výzkum a jiní odkazovali na děti, kterými se embrya mohou stát. Tyto důvody jsou časté a podobné těm, jež uváděli pacienti i v předchozích studiích [11]. V australské studii rodiče 5letých dětí po IVF, kteří byli dotazováni ohledně využití zamrazených embryí pro výzkumné účely, často o těchto embryích hovořili jako o sourozencích narozených dětí a komentovali psychologické dopady manipulace s embryi pod mikroskopem [12].

Závěr

Etickou komisí LF MU a FN Brno byl vypracován a schválen informovaný souhlas. Je vybráno a zajištěno 160 darovaných embryí. Je vypracován předávací protokol a metodika předávání. Plán předávání rozmrazených anonymizovaných embryí zahrnuje cca 5 rozmrazených blastocyst týdně s provedeným asistovaným hatchingem.

Po předání embryí na CTEF probíhá izolace embryoblastu s následnou kultivací. Ustanovené buněčné linie hESC musí splnit specifikovaná kritéria bezpečnosti, stability a pluripotence. Věříme, že v souladu s plánem projektu získáme nejméně 3 linie hESC v klinické kvalitě, poprvé vytvořené v ČR, respektující požadavky na léčivé přípravky Advanced Medicinal Therapy Products (AMTP).

Obdrženo/Submitted: 11. 12. 2020

Přijato/Accepted: 8. 1. 2021

prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc., MB

Gynekologicko-porodnická klinika

LF MU a FN Brno

Obilní trh 11

602 00 Brno

ventruba.pavel@fnbrno.cz