Expresia karbonickej anhydrázy IX v karcinómoch prsníka

Expression of carbonic anhydrase IX in the breast carcinomas

Objective:
Carbonic anhydrase IX (CA IX) is one indicator of hypoxia in the tumor and its expression is associated with more aggressive forms of breast cancer. The aim of this study is to point out its own set of correlation between CA IX expression and selected morphological and biological indicators.

Type of study:
Cohort prospective study.

Setting:
Department of Pathology of Slovak Medical University and St. Elisabeth Cancer Institute, Bratislava, Slovak Republic.

Methods:
These were 145 cases of breast cancer aged 25 to 85 years (median 59 years) from the Register of the Institute of Pathology and Slovak Medical University and St. Elisabeth Cancer Institute in Bratislava for the period 1. 9. 2012 to 28. 2. 2013. In all cases were examined CA IX, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), HER2, p53 and Ki67 by immunohistochemistry. Typing, grading and staging of the disease were evaluated according to the classification systems currently in place.

Results:
CA IX expression was demonstrated in 51 cases (35.2%). CA IX positivity correlated with the degree of differentiation (p = 0.0001), with ER status (p <0.0001) and PR (p <0.01) and HER2 (p <0.01) and proliferative activity as measured by Ki67 (p <0.001). HER2-positive cancers and triple-negative cancers were more frequently associated with the expression of CA IX compared with luminal subtypes (p <0.0001). The state of CA IX and age range of the tumor – pT and lymph node status - pN and p53 have not been shown statistically significant correlations.

Conclusion:
CA IX examination in breast cancer provides valuable information on the state of hypoxia in the tumor, thereby supplementing view of prognosis of the disease.

Keywords:
breast – carbonic anhydrase IX – immunohistochemistry – prognosis

Authors: K. Kajo ¹; I. Turčan ²; M. Vallová ¹; T. Laboš ¹; M. Kajo ¹; K. Macháleková ¹; Š. Galbavý ^1,3; P. Žúbor ⁴
Authors‘ workplace: Ústav patológie Slovenskej zdravotníckej univerzity a Onkologického ústavu svätej Alžbety, Bratislava, prednosta doc. MUDr. K. Kajo, PhD. ¹; Mammacentrum svätej Agáty, s. r. o., Banská Bystrica, primár MUDr. I. Turčan ²; Ústav súdneho lekárstva Lekárskej fakulty Univerzity Komenského, Bratislava, prednosta prof. MUDr. Š. Galbavý, DrSc. ³; Gynekologicko-pôrodnícka klinika Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského a Univerzitnej nemocnice, Martin, prednosta prof. MUDr. J. Danko, CSc. ⁴
Published in: Ceska Gynekol 2013; 78(3): 263-268

Overview

Ciele štúdie:
Karbonická anhydráza IX (CA IX) je jedným z ukazovateľom hypoxie v nádore a jej expresia je spájaná s agresívnejšími formami karcinómu prsníka. Cieľom predloženej štúdie je na vlastnom súbore poukázať na korelácie medzi expresiou CA IX a vybranými morfologickými a biologickými ukazovateľmi.

Typ štúdie:
Kohortová prospektívna štúdia.

Názov a sídlo pracoviska:
Ústav patológie SZU a OÚSA, Bratislava.

Materiál a metódy:
Išlo o 145 prípadov s karcinómom prsníka vo veku od 25 do 85 rokov (medián 59 rokov) z registra Ústavu patológie SZU a OÚSA v Bratislave za obdobie1. 9. 2012 až 28. 2. 2013. Vo všetkých prípadoch boli imunohistochemicky vyšetrené CA IX, estrogénový receptor (ER), progesterónový receptor (PR), HER2, p53 a Ki67. Typizácia, grading a staging ochorenia boli zhodnotené podľa v súčasnosti platných klasifikačných systémov.

Výsledky:
Expresia CA IX bola dokázaná v 51 prípadoch (35,2 %) a korelovala so stupňom diferenciácie (p=0,0001), so stavom ER (p<0,0001), PR (p<0,01), HER2 (p<0,01) a proliferačnou aktivitou hodnotenou pomocou Ki67 (p<0,001). HER2- pozitívne karcinómy a trojito negatívne karcinómy boli častejšie spojené s expresiou CA IX v porovnaní s luminálnymi podtypmi (p<0,0001). Medzi stavom CA IX a vekom, rozsahom nádoru – pT a stavom lymfatických uzlín – pN a p53 neboli dokázané štatisticky významné korelácie.

Záver:
Vyšetrenie CA IX v karcinómoch prsníka poskytuje cenné informácie o stave hypoxie v nádore, a tým dopĺňa pohľad na prognózu tohto ochorenia.

KĽúčové slová:
prsník – karbonická anhydráza IX – imunohistochémia – prognóza

ÚVOD

Karbonická anhydráza IX (CA IX) je hypoxiou regulovaný membránový glykoproteín, ktorý katalyzuje reverzibilnú premenu oxidu uhličitého na bikarbonát a protóny. Za fyziologických podmienok je CA IX exprimovaná len v žalúdkovej sliznici, v seróznych blanách [22] a v tenkom čreve [19]. Na rozdiel od normálnych tkanív boli zvýšené hladiny CA IX dokázané vo viacerých nádoroch, napr. karcinómoch krčka maternice, pažeráka, čreva a konečníka, obličiek, močového mechúra, prsníka, mezoteliómoch, nemalobunkovom karcinóme pľúc, nádoroch mozgu a nádoroch hlavy a krku [16, 22, 23].

Hypoxia predstavuje patofyziologický stav vyskytujúci sa v solídnych nádoroch, ktorý je spojený s malígnou progresiou, invazivitou,angiogenézou, zmenami metabolizmu a zvýšeným rizikom metastázovania, a preto je ukazovateľom agresívneho správania nádorov [7, 12]. Navyše sa ukázalo, že hypoxia nádorov je asociovaná s rezistenciou na rádioterapiu a chemoterapiu [4, 24], a preto zhodnotenie stavu CA IX môže slúžiť ako prediktívny faktor pri výbere liečebnej modality [12]. Nové poznatky dokonca poukazujú na skutočnosť, že CA IX by sa mohla stať terapeutickým cieľom v prípadoch, ktoré neodpovedajú na klasické druhy chemoterapie a rádioterapie [2, 8, 16, 18, 22].

Vzhľadom na poznatky o prognostickom aj prediktívnom význame CA IX vo viacerých nádoroch sme sa rozhodli pre analýzu expresie CA IX v karcinómoch prsníka a jeho vzťahu k vybraným klasickým morfologickým a biologickým ukazovateľom.

SÚBOR A METODIKA

K analýze bol zostavený súbor karcinómov prsníka z registra Ústavu patológie SZU a OÚSA v Bratislave z obdobia 1.9.2012 až 28.2.2013. Išlo o 145 pacientov vo veku od 25 do 85 rokov (me-dián 59 rokov). Z nich v 42 prípadoch išlo o vzorky z „core cut“ biopsie alebo vákuovej mamotómie, ktoré neumožňovali určiť štádium ochorenia. Ďalších 11 prípadov bolo po neoadjuvantnej terapii, a teda išlo o nádory, ktorých niektoré morfologické charakteristiky boli iatrogénne ovplyvnené predchádzajúcou liečbou. Nádory boli typizované podľa klasifikácie WHO z roku 2012 [14] a rozdelené na invazívne duktálne, lobulárne a iné karcinómy a skupinu duktálnych karcinómov in situ (DCIS). Histologický grading invazívnych karcinómov bol hodnotený podľa Nottinghamskej modifikácie gradingu [6], na stanovenie gradingu DCIS bola použitá Van Nuysska klasifikácia [20] a pri karcinómoch po liečbe sa hodnotil tzv. RCB (residual cancer burden) podľa voľne prístupného nomogramu na oficiálnej web stránke MD Anderson Center, USA (http://www3.mdanderson.org). Štádium ochorenia bolo stanovené podľa kritérií TNM klasifikácie z roku 2010 v 103 prípadoch [5].

Z biologických ukazovateľov boli imunohistochemicky vyšetrené ER (klon 6F11, Novocastra, United Kingdom, riedenie 1:210), PR (klon PgR636, DAKO, Denmark, riedenie 1:150), HER2 (HercepTest, DAKO), p53 (klon DO-7, DAKO, riedenie 1:60) a Ki67 (klon MIB1, DAKO, riedenie 1:230). Vzorky boli štandardne spracované v imunosteineri Leica Bond-Max.

Za pozitívne sa pri ER aj PR považovali prípady s expresiou týchto markerov vo viac ako 1 % nádorových buniek [10]. Pri HER2 sa za pozitívne považovali prípady s intenzitou reakcie 3+ vo viac ako 30 % nádorových buniek alebo prípady s dokázanou amplifikáciou HER2 génu pomocou fluorescenčnej in situ hybridizácie [25]. Molekulové triedy boli zostavené na základe stavu hormónových receptorov, HER2 a proliferačnej aktivity hodnotenej Ki67 [9]. Do luminálnej A skupiny boli zaradené nádory s pozitívnymi hormónovými receptormi, negatívnym HER2 a proliferačnou aktivitou hodnotenou Ki67 do 15 %. Luminálnu B podskupinu tvorili nádory s pozitívnymi hormónovými receptormi a s vysokou proliferačnou aktivitou alebo s koexpresiou HER2. Skupinu čistých HER2-pozitívnych nádorov predstavovali tie, v ktorých boli hormónové receptory negatívne a exprimovali HER2. Poslednú skupinu trojito negatívnych karcinómov tvorili nádory s negatívnymi hormónovými receptormi aj HER2. Okrem toho sme samostatne hodnotili p53, pričom za p53 pozitívne prípady boli považované tie, v ktorých nukleárna expresia p53 bola dokázaná vo viac ako 10 % nádorových buniek.

K imunohistochemickej analýze stavu CA IX bola použitá protilátka M 75 (BioScience Slovakia, s.r.o., riedenie 1:570) zameraná na externú doménu CA IX od prof. RNDr. Silvii Pastorekovej, DrSc. z Virologického ústavu Slovenskej akadémie vied v Bratislave. Za CA IX pozitívne boli považované prípady, v ktorých bolo dokázané farbenie na membráne nádorových buniek bez ohľadu na počet pozitívnych buniek (obr.1–3). Za pozitívne neboli považované prípady s expresiou CA IX v stróme nádoru bez pozitivity epitelovej komponenty. Okolité nenádorové tkanivo bolo negatívne pri dôkaze CA IX.

**Image 1. Membránová pozitivita CA IX v bunkách invazívneho duktálneho karcinómu prsníka**

**Image 2. Expresia CA IX v centrálnej (hypoxiou najviac postihnutej) časti duktálneho karcinómu in situ**

**Image 3. Detail na membránovú expresiu CA IX**

Pre koreláciu jednotlivých parametrov sme využili lineárnu koreláciu a Pearsonov korelačný koeficient. P hodnota < 0,05 bola použitá za signifikantný rozdiel. Na štatistické spracovanie sme použili program MedCalc (11.0.1., Belgicko).

VÝSLEDKY

Celkovo bola expresia CA IX dokázaná v 51 prípadoch (35,2 %). Korelácie medzi stavom CA IX a jednotlivými klasickými morfologickými a biologickými ukazovateľmi sú zobrazené v tabuľkách 1 a 2. Čím horšie diferencované boli invazívne nádory bez predchádzajúcej liečby, tým viac narastal počet prípadov s expresiou CA IX (p = 0,0001). V skupine duktálnych in situ karcinómov (DCIS) bola pozitivita CA IX zaznamenaná prevažne v skupine high-grade DCIS.

**Table 1. Korelácia stavu CA IX s klasickými morfologickými ukazovateľmi**

**Table 2. Korelácia stavu CA IX s biologickými ukazovateľmi**

Pri biologických faktoroch expresia CA IX korelovala so stavom ER (p < 0,0001), PR (p < 0,01) a HER2 (p < 0,01) ako aj s proliferačnou aktivitou hodnotenou pomocou Ki67 (p < 0,001). Pritom v nádoroch s luminálnym A podtypom karcinómu bola expresia CA IX zriedkavejšie zaznamenaná v porovnaní s luminálnymi B-podtypmi a HER2-pozitívnym podtypom, ako aj skupinou trojito negatívnych karcinómov (p < 0,0001). Na druhej strane medzi stavom CA IX a vekom, rozsahom nádoru – pT a stavom lymfatických uzlín – pN a p53 neboli dokázané štatisticky významné korelácie. Prípady s pozitívnou CA IX boli častejšie v skupine duktálnych invazívnych karcinómov a skupine DCIS (39,3 %, resp. 50 %) oproti lobulárnym alebo iným karcinómom (7,7 %, resp. 20,0 %), avšak celkovo rozdiely medzi typmi neboli štatisticky signifikantné.

DISKUSIA

Karbonické anhydrázy predstavujú skupinu 16 metaloenzýmov, ktorých hlavnou enzymatickou úlohou je katalyzovať reverzibilnú premenu oxidu uhličitého na bikarbonát a protóny, a tak tvoria súčasť komplikovaného systému regulácie acidobazickej rovnováhy. Okrem toho karbonické anhydrázy pôsobia v mnohých fyziologických procesoch, ako sú respirácia, regulácia acidobázickej rovnováhy, pri kostnej resorpcii, kalcifikácii a v biosyntetických reakciách, ako napr. lipogenéze, glukoneogenéze a ureagenéze [16, 22]. Dve ich izoformy, a to CA IX a CA XII, sa vyskytujú v súvislosti s nádorovou progresiou a odpoveďou na liečbu [16]. Regulácia pH v nádorovom tkanive je zabezpečená cestou expresie CA IX, čo vedie k zachovaniu prežívania nádorových buniek [16].

Membránová pozitivita CA IX bola dokázaná v 11–48 % karcinómov prsníka [1, 4, 12, 13, 15]. V našom súbore sme expresiu CA IX zaznamenali v 35 % prípadov a tento stav koreloval so stupňom diferenciácie, ako aj so stavom vybraných biologických ukazovateľov, napr. ER, PR, HER2 a Ki67. Azda najvýraznejšie sa korelácia stavu CA IX ukázala vo vzťahu k molekulovým triedam, kde expresia CA IX narastala od luminálnych podtypov a najvyššia bola v prognosticky najhorších, t.j. v HER2-pozitívnom a trojito negatívnom podtype. Aj v literatúre bola opísaná omnoho vyššia expresia CA IX v bazaloidných karcinómoch v porovnaní s luminálnymi podtypmi [4] a taktiež bola asociovaná s expresiou HER2 [1], čo potvrdzujú aj naše výsledky. Tento fenomén súvisí najmä s negativitou ER, nakoľko chronická hypoxia znižuje reguláciu ER, a preto CA IX môže byť významným ukazovateľom poukazujúcim na tento stav [3]. Z hľadiska typizácie bola pozitivita CA IX dokázaná najmä v duktálnych typoch karcinómov [4]. V našej práci sme síce nezaznamenali štatisticky významnú koreláciu medzi nami sledovanými nádorovými typmi, ale prevažná časť CA IX pozitívnych prípadov bola tiež v skupine duktálnych karcinómov, či už invazívnych, alebo neinvazívnych.

Expresia CA IX poukazuje aj na vyšší metastatický potenciál nádoru, pretože pri okyslení mikroprostredia sa znižuje adhézia buniek, zvyšuje sa bunková motilita, migrácia a indukuje sa vaskularizácia aktiváciou proteáz [8, 16]. Preto výsledky najnovších prác definitívne dokázali, že CA IX je nezávislým biomarkerom zlej prognózy na zhodnotenie rizika vzdialených metastáz aj celkového prežívania [15]. Okrem tkanivového vyšetrenia na dôkaz expresie CA IX je možné tento marker sledovať aj v krvi. Výsledky niektorých prác ukázali, že sérové hladiny CA IX pri metastatických karcinómoch prsníka korelovali so zlou prognózou a tiež prítomnosťou cirkulujúcich nádorových buniek [17]. V našom súbore sme síce nedokázali koreláciu medzi hodnotenými ukazovateľmi štádia ochorenia, ako boli rozsah nádoru (pT) a stav lymfatických uzlín (pN), ale prípady s kompletnými údajmi na zhodnotenie štádia ochorenia tvorili len približne dve tretiny celkového súboru, a preto bude potrebné rozšíriť súbor o ďalšie prípady s kompletnými údajmi.

Dôležitým cenným poznatkom získaným zo štúdie CA IX je, že okrem prognostického významu môže byť zhodnotenie stavu CA IX ukazovateľom rezistencie na externú rádioterapiu a chemoterapiu [4, 24]. Z literatúry je známe, že približne 40 % všetkých karcinómov prsníka a 50 % lokálne pokročilých prsníkových karcinómov je hypoxických a ich zmenený metabolizmus je spojený s rezistenciou na rádioterapiu a systémovú liečbu [24]. Detekcia stavu CA IX by preto mohla slúžiť aj na identifikáciu pacientov s vyšším rizikom relapsu, ktorí budú vyžadovať adjuvantnú terapiu [12]. Na druhej strane niektorí autori poukazujú na to, že adjuvantná liečba, či už chemoterapia, hormónoterapia alebo rádioterapia, budú úspešnejšie u pacientov, ktorí budú mať nízku hladinu CA IX, a preto CA IX nie je prognostickým, ale skôr prediktívnym faktorom [21]. V našom súbore sme mali len 11 prípadov po neoadjuvantnej liečbe, pričom paradoxne viac pozitívnych prípadov bolo v skupine prípadov s RCB2, t.j. s parciálnou patologickou odpoveďou ako v RCB3, do ktorej sú zaradené prípady s chemorezistentnými nádormi. Vzhľadom na malý počet zhodnotených prípadov po liečbe však nie je možné vyjadriť závery. Expresia CA IX koreluje so skráteným obdobím do progresie a celkovým prežívaním u pacientov, ktorí boli liečení doxorubicínom bez vzťahu k amplifikácii HER2 a TOP2A. Preto detekcia CA IX môže poskytovať cenné informácie pre výber primeraného tera-peutického režimu [3].

ZÁVER

Vyšetrenie CA IX v karcinómoch prsníka poskytuje cenné informácie o stave hypoxie v nádore, čím dopĺňa pohľad na prognózu tohto ochorenia. Na zhodnotenie jeho významu pre výber adjuvantnej terapie však budú potrebné ďalšie rozmernejšie štúdie s komplexnejšími analýzami prežívania.

Poďakovanie

Touto cestou sa chceme poďakovať prof. RNDr. Silvii Pastorekovej, DrSc. z Virologického ústavu SAV za poskytnutie protilátky M75, ktorú sme mohli odskúšať na vzorkách z nádorov z nášho registra Ústavu patológie SZU a OÚSA. Podporené z grantu VEGA 1/0243/12 MŠ SR.

Práca bola prezentovaná vo forme prednášky na 18. Celoštátnej pracovnej konferencii SEKCAMA v Bratislave 25.-26. apríla 2013.

Doc. MUDr. Karol Kajo, PhD.

Ústav patológie SZU a OÚSA

Heydukova 10

812 50 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: kkajo@ousa.sk

Sources

1. Bartosova, M., Parkkila, S., Pohlodek, K., et al. Expression of carbonic anhydrase IX v breast is associated with malignant tissues and is related to overexpression of cerbB2. J Pathol, 2002, 197, p. 314–321.

2. Bennewith, KL., Dedhar, S. Targeting hypoxic tumour cells to overcome metastasis. BMC Cancer, 2011, 11, p. 504.

3. Betof, AS., Rabbani, ZN., Hardee, ME., et al. Carbonic anhydrase IX is a predictive marker of doxorubicin resistance in early-stage breast cancer independent of HER2 and TOP2A amplification. Br J Cancer, 2012, 106, p. 916–922.

4. Brennan, DJ., Jirstrom, K., Kronblad, A., et al. CA IX is an independent prognostic marker in premenopausal breast cancer patients with one to three positive lymph nodes and a putative marker of radiation resistance. Clin Cancer Res, 2006, 12, p. 6421–6431.

5. Edge, SE., Byrd, DR., Compton, CC., et al. AJCC Cancer Staging Handbook. From the AJCC Cancer Staging Manual,7th ed., Springer 2010, pp. 718, ISBN 978-0-387-88442-4.

6. Elstonm, CW., Ellis, IO. Pathological prognostic factors in breast cancer I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term followup, Histopathology, 1991, 19, p. 403–410.

7. Favaro, E., Lord, S., Harris, AL., Buffa, FM. Gene expression and hypoxia in breast cancer. Genome Med, 2011, 3, p. 55.

8. Gieling, RG., Williams, KJ. Carbonic anhydrase IX as a target for metastatic disease. Bioorg Med Chem, 2012, doi: 10.1016/j.bmc.2012.09.062.

9. Goldhirsch, A., Wood, WC., Coates, AS., et al. Strategies for subtypes – dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol, 2011, 22, p. 1736–1747.

10. Hammond, ME., Hayes, DF., Dowsett, M., et al. American Society of Clinical Oncology / College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol, 2010, 28, p. 2784–2795.

11. http://www3.mdanderson.org

12. Hussain, SA., Ganesan, R., Reynolds, G., et al. Hypoxia-regulated carbonic anhydrase IX expression is associated with poor survival in patients with invasive breast cancer. Br J Cancer, 2007, 96, p. 104–109.

13. Chia, SK., Wykoff, CC., Watson, PH., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol, 2001, 19, p. 3660–3668.

14. Lakhanim, SR., Ellis, IO., Schnitt, SJ., et al. WHO Classification of tumours of the breast. Lyon, IARC, 2012, pp. 240.

15. Lou, Y., McDonald, PC., Oloumi, A., et al. Targeting tumor hypoxia: suppression of breast tumor growth and metastasis by novel carbonic anhdrase IX inhibitors. Cancer Res, 2011, 71, p. 3364–3376.

16. McDonald, PC., Winum, JY., Supuran, CT., Dedhar, S. Recent developments in targeting carbonic anhydrase IX for cancer therapeutics. Oncotarget, 2012, 3, p. 84–97.

17. Muller, V., Riethdorf, S., Rack, B., et al. Prospective evaluation of serum tissue inhibitor of metallloproteinase I and carbonic anhydrase IX in correlation to circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer. Breast Cancer Res 2011, 13, p. R71.

18. Pastorekova, S., Zavada, J. Carbonic anhydrase (CA IX) as a potential target for cancer therapy. Review article. Cancer Ther, 2004, 2, p. 245–262.

19. Saarnio, J., Parkkila, S., Parkkila, AK., et al. Immuno-histochemistry of carbonic anhydrase IX (MN/CAIX) in human gut reveals polarized expression in the epithelial cells with the highest proliferative capacity. J Histochem Cytochem, 1998, 46, p. 497–504.

20. Silverstein, MJ. The University of Southern California/Van Nuys prognostic index for ductal carcinoma in situ. Am J Surg, 2003, 186, p. 337–343.

21. Span, PN., Bussink, J., de Mulder, PH., Sweep, FCGJ. Carbonic anhydrase IX expression is more predictive than prognostic in breast cancer. Br J Cancer, 2007, 96, p. 1309.

22. Supuran, CT. Inhibition of carbonic anhydrase IX as a novel anticancer mechanism. World J Clin Oncol, 2012, 3(7), p. 98–103.

23. Takacova, M., Bartosova, M., Skvarkova, L., et al. Carbonic anhydrase IX is a clinically significant tissue and serum biomarker associated with renal cell carcinoma. Oncol Letters, 2013, 5, p. 191–197.

24. Ward, C., Langdon, SP., Mullen, P., et al. New strategies for targeting the hypoxic tumour microenvironment in breast cancer. Cancer Treat Rev, 2013, 39(2), p. 171–179.

25. Wolff, AC., Hammond, ME., Schwartz, JN., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol, 2007, 25, p. 118–145.