Detekce nádorových kmenových buněk karcinomu ovaria

Souhrn

Cíl práce:
Detekce nádorových kmenových buněk karcinomu ovaria, jejich vztah k celkovému přežití, k bezpříznakovému období. Srovnání výsledků s výsledky dostupnými z literatury.

Typ studie:
Původní práce.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN Plzeň, Šiklův patologicko-anatomický ústav LF UK a FN Plzeň.

Metodika:
Do studie bylo zařazeno 23 vzorků serózního karcinomu ovaria, 4 vzorky endometroidního karcinomu ovaria. Vzorky byly obarveny specifickými protilátkami proti povrchovým antigenům CD44, CD133. Reakce s povrchovými antigeny nádorových kmenových buněk byla odečtena pro definované zorné pole. Výsledky byly korelovány s bezpříznakovým obdobím a celkovým přežitím.

Výsledky:
Pro vzorky zkoumané protilátkami proti CD44 nevyšla statisticky významná korelace mezi celkovým přežitím, bezpříznakovým obdobím a expresí CD44 vyjádřenou v procentech na zorné pole. Vzorky zkoumané protilátkou proti povrchovému antigenu CD133 nebylo možné hodnotit pro nízkou reakci protilátka – antigen.

Závěr:
V naší studii jsme pomocí protilátky CD44 neprokázali vliv nádorových kmenových buněk na celkové přežití ani na bezpříznakový interval, přestože v jiných studiích to bylo prokázáno. Pro detekci nádorových kmenových buněk s povrchovým znakem CD133 by bylo vhodné použít jinou protilátku. Statistické hodnocení bylo limitováno velikostí hodnoceného souboru.

Klíčová slova:
CD44 – CD133 – ovariální karcinom – nádorové kmenové buňky

ÚVOD

Zhoubné nádory ovaria jsou nejčastější příčinou úmrtí na gynekologické zhoubné nádory. Incidence ovariálního karcinomu v ČR v roce 2010 byla 20,64 na 100 tisíc žen, mortalita 12,58 na 100 tisíc žen [4]. Diagnostiku karcinomu ovaria i jeho terapii provází mnoho obtíží. Karcinom ovaria je typicky diagnostikován v období kolem 60 let věku, nicméně je stále častěji diagnostikován i u mladých žen do třiceti let. Bohužel není zatím znám žádný efektivní screening a často je karcinom ovaria diagnostikován v pokročilém stadiu onemocnění. Léčba je založena na chirurgickém odstranění tumoru a chemoterapii. Většinou je použita kombinace platinových derivátů (karboplatina, cisplatina) a taxanů. Chemoterapie je ale velmi často komplikována vznikem rezistence, především u recidiv. Mechanismus vzniku rezistence není znám.

V současné době se věnuje velká pozornost nádorovým kmenovým buňkám, které by se mohly podílet na růstu nádoru, metastazování a vzniku chemorezistence. Nádorové kmenové buňky jsou subpopulací buněk s typickými vlastnostmi kmenových buněk – to je schopností sebeobnovy a diferenciace v různé buněčné typy, dále schopností propagace tumoru in vivo a expresí povrchových markerů. Přítomnost nádorových kmenových buněk byla prokázána u mnoha solidních tumorů.

Identifikovat nádorové kmenové buňky (CSCs) není jednoduché. Na povrchu buněčných membrán bylo zjištěno několik znaků typických pro CSCs. Obvykle jsou detekovány pomocí imunohistochemie, popřípadě průtokovou cytometrií. V několika studiích byly nádorové buňky izolovány, a poté transplantovány do myšího modelu, ve kterém se vytvořil tumor se znaky nádorových kmenových buněk.

Mezi hlavní povrchové znaky patří CD44, transmembránová adhezivní molekula typu I o molekulární hmotnosti 85–90 kDa. Jde o glykoprotein s rozsáhlou glykosylací s vazbou přes kyslík a šesti potenciálními glykosylačními místy s vazbou přes dusík. Část N-koncové domény CD44 vykazuje homologii s částí proteoglykanového jádra chrupavky a vazebnými proteiny. CD44 je povrchový receptor buněk pro hyaluronát, což svědčí pro jeho možnou úlohu při regulaci interakcí buněk, interakcí buněk se substrátem a migraci buněk [1]. CD44 je exprimován u širokého spektra buněk. V krvetvorném systému je přítomen na monocytech, granulocytech, erytrocytech, B-buňkách a zralých T-buňkách. Mimo krvetvorný systém je exprimován na epiteliálních buňkách, fibroblastech, kosterních svalech, bílé hmotě v centrální nervové soustavě a širokém spektru tumorů [7]. CD44 byl detekován ve standardní formě a také ve variantních izoformách [11].

Dalším důležitým znakem je CD133, prominin, který hraje roli při tvorbě výběžků povrchové membrány, důležitých pro pohyb buněk ve tkáni. V naší studii jsme pro detekci nádorových kmenových buněk použili právě tyto CD znaky a posuzovali jsme jejich prognostickou hodnotu.

Bylo objeveno mnoho dalších znaků, které by mohly pomoci při detekci CSCs, např. CD117, receptor pro tyrosinkinázu. Dále se studuje vliv exprese aldehyd dehydrogenázy (ALDH) na vznik chemorezistence a pomoc při detekci nádorových kmenových buněk.

SOUBOR A METODIKA

Do naší studie bylo zařazeno 27 vzorků karcinomu ovaria: 23 vzorků serózního karcinomu ovaria, 4 vzorky endometroidního karcinomu ovaria, převážně stadia III podle FIGO (18 vzorků), dále stadia IV (5 vzorků), II (2 vzorky), I (2 vzorky). Celkem 7 pacientek již absolvovalo neodjuvantní chemoterapii. Průměrný věk pacientek při stanovení diagnózy byl 62 let. Retrospektivně byla dohledána data. U 20 pacientek byla primární léčba operační, 7 pacientek podstoupilo neadjuvantní chemoterapii. U 13 pacientek byla operace radikální s nulovým reziduem tumoru. U žádné pacientky nebyl reziduální tumor ohodnocen mezi 0–2 cm3, u 14 pacientek bylo reziduum více než 2 cm3. Hodnocena byla senzitivita onemocnění na chemoterapii na bázi platiny. Platina-rezistentní onemocnění bylo hodnoceno jako perzistence, progrese onemocnění nebo vznik recidivy do 6 měsíců po ukončení základní léčby (8 pacientek). Ve skupině intermediate byla recidiva diagnostikována od 6 do 12 měsíců po ukončení základní léčby (2 pacientky). Jako platina-senzitivní karcinom bylo hodnoceno, pokud se recidiva objevila po 12 měsících od ukončení základní léčby (14 pacientek). Bezpříznakové období (DFI) bylo počítáno od ukončení základní léčby do relapsu onemocnění, celkové přežití bylo počítáno od data stanovení diagnózy onemocnění do úmrtí pacientky (tab. 1).

Byly vyhledány parafinové bločky, následně nakrájeny na řezy o síle 5 µm, deparafinizovány, rehydratovány a poté obarveny podle obecného postupu na ruční IHC/TL jednak monoklonální myší protilátkou proti CD44, typ IgG1, kappa (Monoclonal Mouse Anti-Human CD44, Phagocytic Glycoprotein-1, Clone DF1485, 1 ml, Code M7082, DAKO, Glostrup, Denmark), a také monoklonální myší protilátkou proti CD133, typ IgG1 (CD133/1 pure human, 50 µg in 1 ml, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Protilátka proti CD133 byla ředěna nejprve 1:100 podle obecného doporučení, ale při tomto ředění nebyly vzorky dobře obarveny, a proto jsme zvolili ředění 1:50.

Reakce protilátka – antigen protilátek proti CD44 i CD133 probíhá především na povrchové membráně buňky. Jako kontrola kvality obarvení sloužily makrofágy, na kterých by také měla proběhnout reakce antigen – protilátka. Reakce byla hodnocena patologem na definované zorné pole. Detekce CD44, CD133 byla hodnocena jako negativní, nebo pozitivní. Hranice pro pozitivitu vzorku byla zvolena na 25 % pozitivních buněk zorného pole při zvětšení 200krát.

VÝSLEDKY

Detekci nádorových kmenových s expresí CD133 nebylo možné hodnotit při použití monoklonální myší protilátky CD133, typ IgG1. Podle kontrolních vzorků bylo obarvení nekvalitní i přes různé koncentrace barvení (1:100, 1:50).

Klinickopatologická data pacientek a jejich vliv na expresi CD44 byly statisticky hodnoceny pomocí Fischerova exaktního testu, celkové přežití a bezpříznakové období pomocí Wilcoxonova testu (tab. 2)

Neprokázali jsme statisticky významnou korelaci mezi expresí CD44 a histologickým typem nádoru (p = 0,2). U serózního karcinomu ovaria byla exprese CD44 pozitivní ve 26 %, u endometroidního karcinomu v 75 %.

Dále bylo hodnoceno stadium tumoru a jeho vztah k expresi CD44 – bez statické významnosti (p = 0,3). U stadia I a II podle FIGO byly 2 ze 4 vzorků pozitivní (50 %), ve stadiu III podle FIGO bylo pozitivních 5 z 18 vzorků (28 %), ve stadiu IV podle FIGO 2 vzorky z 5 (40 %).

Důležitým faktorem je senzitivita tumoru na chemoterapii na bázi platiny. Ve skupině chemosenzitivních (14 vzorků) bylo detekováno 6 pozitivních na CD44 (43 %), ve skupině intermediate (2 vzorky) nebyl žádný vzorek pozitivní. Ve skupině chemorezistentní (8 vzorků) byly zjištěny 2 pozitivní vzorky na CD44 (25 %). Výsledky nejsou statisticky významné (p = 0,5).

Důležitým parametrem, který byl hodnocen, je celkové přežití (OS), jež bylo 39,8 ± 26 měsíců s minimem 1 měsíc a maximem 78 měsíců, 8 pacientek žije. U 4 pacientek nebylo možné dohledat data. Soubor byl hodnocen z hlediska pětiletého a tříletého přežití. U osmi pacientek s pětiletým přežitím byla pozitivní detekce CD44 na 1 vzorku (13 %). U dvou pacientek s tříletým přežitím byla pozitivní reakce na 1 vzorku (50 %). Výsledky nejsou statisticky významné; počítáno Wilcoxonovým testem (0,2).

Posledním hodnoceným parametrem bylo bezpříznakové období (DFI), které bylo 15 ± 10 měsíců. Nebyla zjištěna statistická významnost mezi bezpříznakovým obdobím a expresí CD44.

DISKUSE

Nádorové kmenové buňky a jejich detekce pomocí povrchových znaků CD44 a CD133 jsou často terčem vědecké pozornosti. Studie, které byly dosud na toto téma publikovány, dospěly k protichůdným závěrům. Ve studii Zhang et al. [10] prokázali, že exprese standardní formy CD44 koreluje s nižší diferenciací tumoru a s pokročilým stadiem onemocnění, ale nekoreluje s celkovým přežitím ani s bezpříznakovým obdobím. Podle jejich závěru není tento znak vhodný jako prognostický faktor. Podle studie Sillanpää et al. [6] je exprese CD44 asociována s dobře diferencovaným tumorem, s mucinózním histologickým typem a s časným stadiem tumoru.

Ferrandina et al. [2] se věnovali expresi CD133. V této studii nebyla prokázána statisticky významná korelace mezi expresí CD133 a celkovým přežitím ani bezpříznakovým obdobím. Podle této studie CD133 není vhodný prognostický faktor.

Ve studii od Zhanga et al. [11] bylo prokázáno, že exprese CD133 je spojena s horší prognózou ovariálního karcinomu, neboť je zde statisticky významná asociace mezi expresí CD133, celkovým přežitím i bezpříznakovým obdobím.

Steffensen et al. [8] ve své studii prokázali, že počet CD44 pozitivních CSCs byl signifikantně vyšší u pacientů s počátečním stadiem ovariálního karcinomu než u pacientů s pokročilým tumorem a také byl spojen s kratším intervalem bez progrese nádoru.

Kromě znaků CD44 a CD133 jsou používány k detekci CSCs také další povrchové markery. Mezi ně patří CD117 – receptor pro tyrosinkinázu. Luo et al. [3] identifikovali a izolovali tumorigenní buňky s expresí CD117+. Imunohistochemicky byly analyzovány pacientky s ovariálním serózním adenokarcinomem, ve 40 % z nich byla prokázána pozitivita exprese CD117, jež statisticky korelovala s rezistencí na konvenční chemoterapii. Dalším zkoumaným znakem je ALDH – aldehyd dehydrogenáza, ve studiích často zkoumaná v kombinaci s dalšími povrchovými markery. Wang et al. [11] ukázali, že ALDH aktivita je asociována s expresí CD44, se vznikem chemorezistence a s horší prognózou.

Ricci et al. [5] hodnotili ve své studii aktivitu ALDH společně s pozitivitou CD133. V této studii nebyla prokázána statisticky významná korelace s odpovědí na chemoterapii, s celkovým přežitím ani s bezpříznakovým obdobím.

Z uvedeného přehledu studií zabývajících se detekcí nádorových kmenových buněk pomocí specifických povrchových znaků a jejich prognostického významu je zřejmé, že je zde stále mnoho kontroverzních výsledků. Limitací naší studie může být počet vzorků zařazených do studie. Podle mého názoru je vhodné naši pilotní studii rozšířit a potvrdit výsledky na větším počtu vzorků.

ZÁVĚR

V naší studii jsme pomocí protilátky CD44 neprokázali vliv nádorových kmenových buněk na celkové přežití ani na bezpříznakové období, přestože v jiných studiích to bylo prokázáno. Podle našich výsledků nemá histologický typ tumoru vliv na expresi CD44. Neprokázali jsme statistickou významnost mezi expresí CD44 a senzitivitou na chemoterapii na bázi platiny. Podle naší studie není CD44 vhodný prognostický faktor.

Pro detekci nádorových kmenových buněk s povrchovým znakem CD133 by bylo vhodné použít jinou protilátku.

Práce byla podpořena ze Specifického vysokoškolského výzkumu č. 266801.

MUDr. Alena Bartáková

Gynekologicko-porodnická klinika

LF UK a FN

Alej Svobody 80

323 00 Plzeň

e-mail: bartakovaa@fnplzen.cz