Vaskulární endoteliální faktor D potenciální prediktor a screeningový marker karcinomu ovaria

Souhrn

Úvod: Dosud stále platí, že pozdní záchyt onemocnění karcinomem vaječníku je zásadní příčina jeho špatné prognózy. Zatím nebyl identifikován žádný dostatečně senzitivní a zároveň specifický marker ani kombinace markerů a zobrazovacích metod, které by jednoznačně umožňovaly záchyt časných, potenciálně dobře kurabilních stadií a dále prebiopticky diferencovaly skupinu ultrazvukově špatně odlišitelných benigní lézí od maligních tumorů. V designu retrospektivní studie byly zkoumány hladiny sérového vaskulárního endoteliálního faktoru D (VEGF-D). VEGF-D má vztah k nádorem indukované angiogenezi, lymfangiogenezi a remodelaci cév s efektem facilitace metastazování a zlepšené distribuce kyslíku a živin pro nádorovou tkáň. Na druhou stranu lymfatická síť slouží jako bariéra proti nádorové diseminaci a je to transportní systém pro imunitně činné elementy v potlačování nádorového bujení. Cílem studie bylo prověřit, zda existuje rozdíl v hladinách sérového VEGF-D ve skupině pacientek s maligními tumory, s benigními lézemi vaječníku a u zdravých kontrol bez patologického nálezu na adnexech. Metody: Retrospektivně bylo zhodnoceno 162 sér odebraných předoperačně a uchovaných procesem mrazení v biobance v letech 2022–2023. Testovaný soubor byl stratifikován na základě histopatologického výsledku vyšetření adnex na skupinu maligních tumorů (n = 54), skupinu benigních lézí (n = 47) a skupinu zdravých kontrol (n = 61). Ke statistickému vyhodnocení parametrů byly použity metody deskriptivní statistické analýzy. Pro porovnání sérových hladin VEGF-D byly použity neparametrické testy. Všechny analýzy byly uvažovány na hladině významnosti 5 %. Sérový VEGF-D byl analyzován metodou ELISA Quantikine® Human VEGF D R&D Systems a hodnoty byly odečteny spektrofotometricky na readeru TECAN. Výsledky: Výsledek srovnání deskriptivních statistických parametrů je ve vyšetřovaném souboru statisticky významný (p = 0,00067) pro rozdíl mezi hodnotami sérového VEGF-D v souboru benigních lézí a maligních tumorů. Dále existuje statisticky významný rozdíl mezi hodnotami pacientek s maligními tumory a mezi zdravými kontrolami (p = 0,0008). Mezi hodnotami u pacientek s benigními lézemi a u zdravých kontrol nebyl nalezen statisticky významný rozdíl (p = 0,4308). Ve srovnání s konvenčním markerem CA125 korelovala patologicky zvýšená hladina sérového CA125 s nízkou hodnotou sérového VEGF-D u pacientek s maligními tumory. Stejná shoda panovala ve srovnání s markerem HE4: vysoké sérové hladiny HE4 byly ve skupině pacientek s maligním tumorem doprovázeny nízkou hladinou VEGF-D, navíc v bodovém grafickém zobrazení se jasně stratifikovala skupina pacientek s maligními tumory od skupiny benigních lézí a zdravých kontrol. Závěr: S ohledem na získané výsledky má vyšetřování sérové hladiny VEGF-D potenciál diagnostického testu s přínosem ke stratifikaci obtížně prebiopticky diferencovatelných adnextumorů.

Klíčová slova:

ovariální karcinom – gynekologická onkologie – lymfangiogeneze – VEGF-D

Úvod

Důvodem k evaluaci screeningového potenciálu vaskulárního endoteliálního faktoru D (VEGF-D) je přetrvávající absence metody nebo jejich kombinace zachycující karcinom vaječníku v časném, potenciálně dobře kurabilním stadiu. Stále platí, že pozdní záchyt onemocnění karcinomem vaječníku je zásadní příčina jeho špatné prognózy. Pětileté přežití ve skupině pokročilých onemocnění nepřesahuje 30 % oproti více než 90% přežití ve skupině časných fází onemocnění. Dosud neexistuje populační screeningová metoda. První hypotéza, kterou jsme postulovali, je, že sérová hodnota VEGF-D bude využitelná pro screeningové účely. Druhou hypotézou a cílem výzkumné práce je ověření přínosu hodnoty sérové hladiny VEGF-D v prebioptickém diagnostickém protokolu adnextumorů. Zejména nás zajímal přínos v řešení ultrazvukově obtížně diferencovatelné skupiny adnextumorů, jako jsou ovariální fibromy, thékomy, některé borderline tumory či kystomy u mladých pacientek plánujících těhotenství, kde je snaha minimalizovat zbytečné operační vstupy. Diagnóza adnextumorů se stanovuje histologicky z celého bezpečně odstraněného tumoru. Biopsie z tumorů, které jsou lokalizovány pouze v oblasti adnex, bez šíření na okolní orgány a peritoneum, se nedoporučuje pro riziko up-stagingu. Naopak pokročilá stadia s metastatickými procesy na peritoneu či v omentu jsou indikována k biopsii buď metodami intervenční radiologie, nebo v rámci diagnostické laparoskopie před zahájením neoadjuvantní systémové léčby.

Termín karcinom vaječníku v současné době zahrnuje široké spektrum histopatologických entit, které mají původ v maligních kmenových buňkách pocházejících z mülleriánského traktu. Patří sem karcinomy vaječníku, vejcovodu a karcinomy primárně diagnostikované na pobřišnici – primární peritoneální karcinom. Karcinom vaječníku nepatří mezi časté nádory a jeho celoživotní riziko v geneticky nezatížené populaci se pohybuje kolem 2 % [1]. Incidence za rok 2021 byla v ČR 17,36 nových případů na 100 000 žen, což odpovídá v absolutních číslech 925 nových pacientek za rok. Mortalita se pohybuje kolem 700 případů za rok (11,6/100 000/rok) [2]. Z dat Národního onkologického registru (NOR) je zřejmé, že oba parametry incidence a mortalita mají mírně klesající trend, nicméně tento fakt je obtížné interpretovat [2].

Pro karcinom vaječníku neexistuje populační screeningová metoda, a to ani v rámci rizikových skupin. Požadavky na populační test jsou vysoké: co nejvyšší senzitivita (minimálně 75 %) a specificita (99,6 %) [3,4]. V průběhu minulých let bylo organizováno několik klinických studií prověřujících kombinace vaginálního ultrazvuku a panelu sérových nádorových markerů, avšak bez úspěchu na vyšší podíl záchytu časných fází onemocnění s lepší nadějí na úplné vyléčení. Nejstarší studií byla americká PLCO (Prostate, Lung, Colorectal, and Ovarian Cancer Screening Trial), která zkoumala účinnost screeningových programů na vyjmenované typy karcinomů [3,5]. Další studií byla UKTOCS (UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening), využívala kombinaci zobrazovací metody (vaginálního ultrazvuku) a panelu sérových markerů. I když multimodální screening vedl k dřívější detekci karcinomu vaječníku, vliv na snížení úmrtnosti nebyl prokázán [6,7]. UKFOCSS (UK Familial Ovarian Cancer Screening Study) se zaměřila na ženy s vysokým rizikem rakoviny vaječníku v důsledku rodinné anamnézy nebo genetické predispozice (nosičství BRCA1, BRCA2 mutace a Lynchova syndromu), tedy screening omezený na rizikovou skupinu pacientek. Nábor probíhal mezi lety 2007 a 2012. Vyšetřování probíhalo formou tzv. ROCA modelu (risk of ovarian cancer algorithm), kdy ženy absolvovaly à 4 měsíce odběr na stanovení sérové hodnoty markeru CA125 a jednou ročně vaginální ultrazvuk. V průběhu studie byla každá pacientka sledovaná 4,5 roku. Ani v tomto uspořádání nebyly získány výsledky směrem ke snížení úmrtnost. Avšak určitá schopnost včasné detekce lokalizovaného karcinomu vaječníku s indikací radikální operace a dobrým výhledem na úplné uzdravení takové pacientky prokázaná byla. Algoritmus ROCA dle výsledků této studie představuje alternativu pro ženy ze skupiny nosiček hereditárních syndromů, pokud odmítají radikální risk redukující salpingooforektomii (preventivní chirurgická resekce obou vaječníků a vejcovodů) [8].

V současné době se uznává tzv. duální model patogeneze karcinomu ovaria [9], který stratifikuje ovariální karcinomy do dvou hlavních typů na základě tkáně původu, histologických charakteristik, typu prekurzorové léze, molekulárních změn a hereditárních genetických predispozic. Celkem je rozřazeno pět subtypů, i když s ohledem na soudobé poznatky z mutační analýzy i dualistický koncept je model zpochybňován. Poslední klasifikace dle Světové zdravotnické organizace (WHO) karcinomů ženského genitálního traktu z roku 2020 nepoužívá typ I a typ II, ale pět hlavních typů ovariálních karcinomů:

high-grade serózní karcinom (HGSC, 70 %);

endometrioidní karcinom (EC, 10 %);

světlobuněčný karcinom neboli clear cell karcinom (6–10 %);

low-grade serózní karcinom (LGSC, 5 %);

mucinózní karcinom (MC, 3–4 %).

 

I tyto skupiny ale do budoucna mohou být rozštěpeny v souvislosti s očekávanými poznatky na základě molekulárních studií [9–12].

Histologicky nejčastějším typem jsou high-grade serózní karcinomy (HGSC) s vysokou proliferační frakcí nádorových buněk. Obecně se jedná o karcinomy chemosenzitivní. Často dojde i k remisi navozené chemoterapií, avšak pravidelně dochází k relapsu a progresi onemocnění, která je pak obtížně léčitelná. Z molekulárně biologického hlediska jde převážně o nádory s chromozomální nestabilitou, která je doprovázena inaktivací tumor supresorového genu TP53. Celkově jde o nádory se špatnou prognózou, které jsou zodpovědné za většinu úmrtí na ovariální karcinom [9,10].

Dosud rozpoznané prekurzorové léze pro HGSC jsou STIC (Serous Tubal Intraepithelial Carcinoma) a SCOuT (Secretory Cell Outgrowth). SCOuT je termín pro drobné proliferace sekretorických buněk a pravděpodobně představuje rané stadium v kaskádě, která vede k tvorbě STIC a HGSC. STIC je považován za hlavní prekurzorovou lézi pro HGSC, nachází se ve fimbriální části sliznice vejcovodu a často vykazuje mutace v TP53 ještě před vznikem HGSC. Epitel vejcovodu je místem vzniku mnoha HGSC [9,13]. Předpokládá se, že léze STIC po deskvamaci může vycestovat z fimbriálního konce vejcovodu a implantovat na pánevní peritoneum, ovarium, viscerální peritoneum kteréhokoli nitrobřišního orgánu. Jednou z popsaných minimálně invazivních cest, jak zachytit deskvamované buňky z prekurzorové léze STIC ve vejcovodu, jsou výplachy dělohy a vejcovodů s následnou analýzou získané tekutiny – IUL (intrauterinní laváž). Studijní skupina prof. Speisera vyvinula a patentovala speciální trojcestný katétr (tzv. Speiser Catheter Ovartec GmbH, Illingen, Německo) k výplachu dutiny děložní a proximální části vejcovodu v ambulantním designu, za sterilních podmínek a v lokální anestezii. Proces si lze přestavit podobně jako zavádění intrauterinního tělíska. Dosud neznáme publikační výstupy ze studie prof. Speisera [14,15].

V diagnostickém protokolu se zásadně využívají tumor markery. Sérové tumor markery jsou snadno dostupné, vyšetření je obvykle ekonomicky málo nákladné, s minimální invazivitou pro pacientku. Přesto se na tomto poli mnoho podstatných změn využitelných populačně od dob zavedení markeru CA125 v roce 1988 neudálo. Přes svou nízkou specificitu zůstává sérová hladina CA125 zlatým standardem v klinických diagnostických protokolech. Ke zvýšení specificity vyšetření existují různé multivariantní panely, které k CA125 doplňují další markery, např. index ROMA, OVA1 nebo RMI. Mnoho klinických studií se zabývalo i ostatními potenciálně využitelnými tumor markery: např. cirkulující miRNA, test metylace, cirkulující nádorová DNA (ctDNA), protilátky proti nádorovým antigenům (AABs) [4]. K identifikaci jednoznačného markeru ani panelu markerů s přesahem směrem k časné detekci ovariálního karcinomu a k prodloužení celkového přežití tak zatím nedošlo [4].

CA125 je membránově asociovaný glykoprotein exprimovaný všemi tkáněmi původně z Müllerových duktů. Embryogeneticky se jedná o diferenciační antigen célomového epitelu a bronchiálního epitelu. S tím souvisí i omezená orgánová specificita. Cut-off pro fyziologickou sérovou hladinu je dohodou stanoveno obvykle na 35 kU/l. Rosen et al. prokázali, že pouze 79 % serózních karcinomů ovaria elevuje nad normu sérovou hladinu, u ostatních 21 % je sérová hladina v normě. V časných stadiích onemocnění má pouze 50 % karcinomů ovaria elevovanou hladinu nad normu. Z epitelových karcinomů ovaria nejvíce zvyšují sérovou hladinu CA125 serózní adenokarcinomy, nejméně světlobuněčné, mucinózní a endometrioidní [16–18]. Specificita je nízká, více než 60 % pacientek s elevovanou hodnotou CA125 netrpí karcinomem ovaria. Elevace CA125 byla zjištěna v průběhu menstruačního cyklu, v těhotenství, u benigních tumorů ovaria (zejména fibromy a fibrothékomy), při pánevní zánětlivé nemoci, při divertikulitidě, při endometrióze, adenomyóze, při jiných maligních onemocněních, jako je karcinom prsu, pankreatu, plic, kolorekta, jater, dělohy a žaludku [4,17,19]. ROCA (Risk of Ovarian Cancer) je analýza, která hodnotí trend sérové hladiny markeru CA125, tzn. nehodnotí jednotlivé měření, ale dynamiku hodnot v čase.

HE4 byl poprvé identifikován v epitelu distální epidydimis v 90. letech 20. století výzkumnou skupinou Pacific Northwestern Research Institute v Seattlu, kteří předpokládali, že se jedná o specifický epididymální tkáňový marker protein, který se účastní procesu maturace spermií [20]. HE4 protein se fyziologicky nevyskytuje ve tkáních ovaria, je over-exprimován ve tkáních karcinomu ovaria, odkud je secernován do extracelulárního prostředí a do krevního řečiště [21]. Souvislost HE4 s karcinomem ovaria byla poprvé publikována Hellstromem et al. v roce 2003 [22].

Z provedených výzkumů víme, že má vysokou specificitu 96 %, avšak nízkou senzitivitu 67 %. Má vyšší senzitivitu pro časná stadia ovariálního karcinomu. Nebývá elevovaný u fyziologického menstruačního cyklu, gravidity či benigních stavů, jako jsou myomatóza a benigní adnextumory [23]. Avšak není specifický pouze pro ovariální karcinom, k jeho elevaci dochází i u karcinomu endometria, plic, prsu a u mezoteliomu. Hladiny HE4 je nutno korelovat v souvislosti s věkem a menopauzálním stavem. S věkem dochází ke zvyšování sérové hladiny HE4. Rovněž je nutno zohledňovat úroveň renálních funkcí a anamnestické informace o užívání hormonální antikoncepce a o kouření. Pro pacientky se sníženou hodnotou glomerulární filtrace se doporučuje korelovat hladinu HE4 na tuto úroveň jako tzv. HE4ren marker. V souvislosti se všemi uvedenými faktory senzitivita i specificita vyšetření HE4 klesá [24]. HE4 má ale i jiné souvislosti než diagnostické a prognostické. Z dalších výzkumů se nyní ukazuje, že HE4 se svou podstatou chová jako antiproteáza a má důležitou roli v procesech karcinogeneze, v metastazování, v angiogenezi a v modelaci imunitních odpovědí v nádoru asociovaném mikroprostředí [24–28]. Zajímavý je vztah HE4 a rodiny VEGF, kterým se zabývá James et al. Z jejich výzkumů bylo postulováno, že sérová hladina HE4 koreluje s úrovní mikrovaskulární denzity [28]. Dále HE4 suprimuje cytotoxické funkce mononukleárů i tumor infiltrujících lymfocytů a celkově působí zásadní pokles imunokompetence v nádorovém mikroprostředí. HE4 není pouhým markerem, ale silným promotorem, který vede ke vzniku agresivních charakteristik ovariálního karcinomu. Níže ve výsledcích našeho výzkumu uvádíme zajímavou shodu mezi hodnotami sérového HE4 a sérového VEGF-D u ovariálního karcinomu oproti rameni pacientek s benigním adnextumorem a oproti zdravým kontrolám.

Takzvaný ROMA index byl představen výzkumným týmem Moore et al. a byl schválen k užívání v diagnostice ovariálního karcinomu v 2010, neboť má větší diagnostickou sílu než užití samotných tumorových markerů CA125 a HE4. Index ROMA je diagnostický nástroj používaný k odhadu rizika malignity ovariálních nádorů. Tento algoritmus je založen na kombinaci dvou sérových markerů a menopauzálního statusu pacientky. Výsledkem je procentuální hodnota, která představuje riziko malignity. Vyšší hodnota ukazuje na větší pravděpodobnost, že nádor je zhoubný [29]. Metaanalýza 5 954 případů retrospektivně hodnocených ukázala 90% senzitivitu a 91% specificitu. Dále bylo zjištěno, že diagnostická přesnost u časných stadií ovariálního karcinomu dosahuje 83 % a senzitivita je vyšší u postmenopauzálních pacientek [29,30]. Nicméně jiné studie zase tuto efektivitu ROMA zpochybnily [31].

Dosud nebyl nalezen marker nebo jejich panel, který by překonal dosud zlatý standard – sérovou hladinu CA125, který je zatím nejvíce klinicky využívaný i přes svou malou specificitu a nízkou senzitivitu v časných stadiích [32–42].

 

Vaskulární endoteliální faktory – regulace angiogeneze a lymfangiogeneze

Nádorová indukce angiogeneze je jedním ze získaných znaků definujících maligní tumor (spolu s poškozenou regulací buněčného cyklu, deregulací apoptózy, schopností pronikat přes bazální membránu) a je původním konceptem Judah Folkmana rozvíjeným od 70. let 20. století [43]. V nádorech je regulace angiogeneze patologicky změněna přepnutím na angiogenní fenotyp – angiogenní switch, ke kterému dochází v raných fázích kancerogeneze. Dochází k němu skokově při vychýlení rovnováhy proangiogenních a antiangiogenních faktorů [44]. Impulzy pro výdej proangiogenních faktorů jsou jednak epigenetické, jednak genetické. Z epigenetických je nejvýznamnější hypoxie. Regulace výdeje vaskulárních endoteliálních faktorů v závislosti na tenzi kyslíku se účastní tumor supresorový gen VHL (von Hippel-Lindau), který za normoxie potlačuje výdej VEGF degradací transkripčního faktoru HIF-1 a (hypoxií indukovaný faktor 1 a). Angiogenní přepnutí je facilitováno expresí onkogenů v nádorových buňkách. Mezi genetické faktory patří např. aktivované onkogeny nebo mutace p53 [43,45].

Potlačování nádorem indukované angiogeneze je v současné době jedním z pilířů moderní cílené onkologické léčby (monoklonální protilátky proti angiogenním faktorům, kompetitivní inhibice receptorů, inhibitory signálních drah).

Ovariální karcinom je metabolicky náročné onemocnění, právě novotvorba cév je odpovědí na zvýšenou poptávku po kyslíku a živinách. Za angiogenezi včetně lymfangiogeneze je zodpovědná rodina vaskulárních endoteliálních faktorů (VEGF). Jedná se o faktory odvozené od krevních destiček (PDGF – platelet derived growth factors), což je jejich původní název. Rodina VEGF zahrnuje: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF (placental growth factor – placentární růstový faktor). Stimulují proliferaci, migraci a přežití aktivovaných endotelových buněk. Za fyziologických okolností jsou esenciální v době embryogeneze. VEGF jsou za fyziologických podmínek produkovány zejména fibroblasty, za patologických podmínek také nádorovými buňkami. Angiogeneze v organizmu dospělé ženy se odehrává pouze v místě hojení ran, ve fertilním věku v endometriu folikulární fáze a v corpus luteum ovaria. Jedná se o složitý proces, mimo aktivovaných endotelií se na něm podílejí hladké svalové buňky, pericyty, adipocyty, fibroblasty, krevní destičky, makrofágy a další. Jejich produkty – angiogenní substance (VEGF, interleukiny, angiopoetiny, proteázy) – nastolují proces označovaný jako pro- angiogenní synergizmus podléhající zpětnovazebným regulacím [44,46]. Vyšetřování hladin VEGF v séru je komplikované procesem krevní srážlivosti. Celkově proces srážení krve zahrnuje komplexní interakce mezi koagulačními faktory, destičkami, endoteliálními buňkami a růstovými faktory, což může vést ke změnám v sérových hladinách různých vaskulárních faktorů, vč. VEGF [44].

V maligní tkáni je proces angiogeneze chaotický, dochází k alternativní novotvorbě cév. Tyto nádorové cévy jsou nevyzrálé, neuspořádané, strukturálně deficientní, bez souvislé bazální membrány, a téměř zcela bez vnější vrstvy podpůrných pericytů. To vede k vysokému průniku plazmy do intersticia (leakage), častému krvácení nebo naopak ke trombózám. Není výjimkou propojování arteriol s venulami se vznikem zkratů. Všechny tyto jevy vedou ke zvýšenému intratumorálnímu tlaku a dalšímu zhoršování hypoxie v tumoru, což zpětnovazebně podporuje další angiogenezi [44–46].

VEGF se s různou specificitou a afinitou vážou na tři typy receptorů. Receptory VEGFR-1 a VEGFR-2 jsou exprimovány na povrchu endotelových buněk krevních cév (VECs – vascular endothelial cells), VEGFR-3 se nachází především na povrchu endotelových buněk lymfatických cév (LECs – lymphatic endothelial cells). VEGFR-1 slouží k signalizaci v době embryogeneze. I když má VEGF asi desetinásobně vyšší afinitu k VEGFR-1, signalizace spouštěná tímto receptorem je velice slabá [44], kanonická angiogeneze probíhá vazbou na VEGFR-2. Lymfagiogeneze je řízena přes VEGFR-3 [47,48]. Důležitým poznatkem je to, že se VEGFR-1 vyskytuje v solubilní formě, ve které funguje jako negativní regulátor angiogeneze. Vazba VEGF na receptory je ještě posílena koreceptory: neuropilin 1 nebo 2 (NRP-1/2). Neuropiliny byly původně identifikovány v neuronech, mají pleiotropní funkci, zasahují nejen do regulace angiogeneze a lymfangiogeneze, ale také do imunitních reakcí, do procesu invaze a metastazování, do rezistence k antiangiogenní terapii [49].

Nejpotentnějším a nejvíce prozkoumaným členem rodiny VEGF je VEGF-A. Byl objeven v roce 1989 a byl označován jako faktor cévní permeability (VPF – vascular permeability factor). Název souvisí s tím, že je padestátisíckrát potentnější v permeabilitě cévní stěny než histamin. Ve starší literatuře, před objevem ostatních členů rodiny VEGF, je označován bez dalšího písmenného indexu. Fyziologicky je nezastupitelný v embryonální angiogenezi, jeho vyblokováním na myším embryonálním modelu uhynou embrya v časné fázi vývoje [48]. Patologicky je VEGF-A produkován endotelovými buňkami kooptovanými nádorem, což vede ke zmíněné chaotické angiogenezi. Stupeň vaskularizace tumorů se označuje termínem (mikro) vaskulární denzita a její posouzení má význam právě v ultrazvukové diagnostice pánevních tumorů (v dopplerovském módu a barevném škálování). Benigní léze jsou typicky avaskulární [50]. Monoklonální protilátka proti VEGF-A bevacizumab je v gynekologické onkologii součástí terapeutického portfolia ovariálního karcinomu a metastatického a rekurentního karcinomu čípku děložního již mnohé roky.

Lymfangiogeneze ve vztahu k biologii nádorů je stále předmětem intenzivního výzkumu často s protichůdnými závěry. Na první poznatky o využití lymfatické vaskulatury nádorem k šíření v organizmu a zakládání metastáz navazují další: lymfagiogeneze v tumorech může být asociována s navozením imunosuprese, resp. imunotolerance [51–76], čímž se i vysvětluje, proč tumory s hustou sítí lymfatik mají horší prognózu. Zcela proti tomu jdou poznatky ze studií na nádorových tkáňových modelech, kde byl podáván VEGF-C s efektem regrese lymfatik [77]. Nyní je známo, že lymfatické uzliny, aby mohly sloužit nádorovým buňkám jako podpůrná struktura, musí projít signifikantní remodelací, zejména metabolickou [78]. Primární nádor nejprve produkcí specifických lymfangiogenních faktorů drénovaných do lymfatik „připravuje“ uzlinu (sinusoidní hyperplazie) k přijetí nádorových buněk a k transformaci na metastatickou uzlinu [54], což je nazýváno teorií semínka a půdy (seed and soil). Sentinelová uzlina je nejprve nádorem alterovaná morfologicky a funkčně, ale v tu chvíli ještě bez průkazu přítomnosti onkologických buněk [70,79]. Z těchto pohledů se jeví role lymfatického systému v nádorové patofyziologii jako konfliktní. Jednak je to síť sloužící k distribuci nádorových buněk, zároveň slouží jako bariéra proti nádorové diseminaci [79]. Tím se posunujeme k recentnímu názoru ohledně lymfatické soustavy v nádorové biologii: podpora lymfangiogeneze současně s metodami podporujícími T-buněčnou specifickou imunitu by mohly být nejvíce efektivní v léčbě nádorových onemocnění.

 

Klinický význam lymfangiogeneze indukované faktorem VEGF-D

Souvislosti mezi VEGF-D a nádorovou lymfangiogenezí a přesah směrem k nádorové progresi, metastazování, k vlivu na parametry intervalu do progrese (PFS – progression free survival) a celkového přežití (OS – overal survival) byly zkoumány v mnoha experimentálních modelech i v klinických studiích. Imunohistochemicky byla zvýšená exprese VEGF-D prokázána u karcinomu plic, prostaty, maligního melanomu, u gynekologických malignit (cervix uteri, ovarium), karcinomu žaludku, karcinomu pankreatu a u metastatického kolorektálního karcinomu [67].

Z experimentálních modelů je to zejména práce Kopfstein et al., 2007, kteří zkoumali myší transgenní modely s navozenou zvýšenou expresí VEGF-D. Pozorovali zvýšenou peritumorální i intratumorální lymfangiogenezi. Funkcionalita nově vzniklých lymfatických cév byla prokázána přítomností nádorových buněčných clusterů. Nádorová lymfangiogeneze byla asociována se zvýšenou přítomností nádorem postižených lymfatických uzlin a s přítomností plicních metastáz. V kontrolní skupině transgenních myší bez zvýšené exprese VEGF-D uvedené jevy chyběly [80]. K podobným závěrům v experimentálních modelech dospěly i jiné výzkumné skupiny, navíc byla popsána role VEGF-D v modelaci de novo vzniklých lymfatických kapilár, jež facilitovala vstup nádorových buněk do lymfatického řešiště [63,80,81].

V několika klinických studiích zkoumajících souvislosti mezi mírou imunohistochemického průkazu VEGF-D ve tkáních maligních tumorů a parametry intervalu do progrese a celkového přežívání jsou výsledky nekonzistentní [80–87].

George et al. 2001, zkoumali soubor kolorektálních karcinomů z operačních výkonů a srovnávali je s benigními polypy z kolonoskopií: imunohistochemicky přítomnost VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, stejné faktory i v séru metodou ELISA a prokazovali VEGF mRNA ve tkáních. Na základě výsledků postulovali závěr, že ve všech případech kolorektálního karcinomu byla přítomnost VEGF-D ve tkáni tumoru snížená, v séru nízké hladiny VEGF-D a nízká přítomnost VEGF-D mRNA. V diskuzi tento fakt vysvětlili kompetitivní inhibicí na receptorech VEGFR-2 a VEGFR-3. VEGF-D je vyvázaný na (solubilních) receptorech a mnohem potentnější VEGF-A a VEGF-C potom ve tkáních vedou k indukci lymfagiogeneze a k metastazování. Jinými slovy jsou nízké hladiny VEGF-D prognosticky závažné [83], resp. poměr mezi VEGF-D a VEGF-C ve prospěch zvýšených hladin VEGF-C je zásadní pro proces nádorové lymfangiogeneze a metastazování [84,85].

Hladiny VEGF-D v séru nebo v plazmě jsou v provedených výzkumech vyšetřovány metodou ELISA (enzyme linked immune-sorbent assay) nebo multiplexovou metodou (např. Luminex) zkoumající více biomarkerů současně, případně nákladnějšími metodami, jako je hmotnostní spektrofotometrie či microarray technologie [80–87].

 

Cíle

Cílem výzkumného projektu je ověřit protein VEGF-D ve smyslu funkčnosti jako diagnostický biomarker.

VEGF-D splňuje definici biomarkeru, neboť je objektivně měřitelný v periferní krvi a je indikátorem patologického procesu: lymfagiogeneze.

Výzkumný projekt testuje, zda hodnota markeru VEGF-D průkazně odlišuje skupiny pacientek s ovariálním karcinomem od pacientek s benigním tumorem adnex oproti zdravým kontrolním skupinám – retrospektivní vyvážená studie případů a kontrol.

Cílem je porovnat sérovou hladinu VEGF-D u pacientek s maligním tumorem, u pacientek s benigním nálezem a u zdravých žen. Popsat vztah mezi sérovou hladinou VEGF-D, klinickými charakteristikami pacientek a hladinou běžně užívaných tumor markerů CA125 a HE4.

 

Metodické postupy, materiální a přístrojové postupy

Metodické postupy

Pro ověření sérové hladiny markeru VEGF-D byl zvolen design retrospektivní vyvážené studie případů a kontrol.

Retrospektivně bylo zhodnoceno 162 předoperačně zmrazených sér v bance biologického materiálu pacientek operovaných v Masarykově onkologickém ústavu v Brně v letech 2022–2024 pro benigní a maligní tumory pánve. Kontrolní skupina byla vytvořena ze sér od zdravých pacientek z preventivní ambulance (profylakticky operovaných pro hereditární nádorové syndromy s negativním histopatologickým výsledkem vyšetření vaječníků a vejcovodů). Pacientky odeslané do konziliární ambulance pro nejasný tumor v pánvi byly týž den odeslány ke krevním odběrům, krevní sérum použité k analýze konvenčních nádorových markerů CA125 a HE4 bylo následně standardním procesem zamraženo a uchováno v bance biologického materiálu pod číselným identifikátorem, který se sestává z pořadového čísla vyšetření v roce 2022 a 2023. Pouze oprávněné osoby, které vstupují do lékařské dokumentace, mohou přiřadit číselný identifikátor vyšetření ke konkrétní pacientce. Stejně tak byly odeslány pacientky z preventivní ambulance před profylaktickou operací k stejným odběrům krve a sérum bylo stejně zamrazeno. Takto uchovaná krevní séra jsou uložena v biobance Masarykova onkologického ústavu 12 měsíců, po uplynutí této lhůty jsou protokolárně likvidována. Všechny pacientky před vstupem do konziliární gynekologické ambulance nebo do preventivní ambulance podepsaly svobodný informovaný souhlas s explicitním dotazem na uchovávání biologického materiálu a jeho využití k vědeckým účelům. Tyto informované souhlasy jsou nedílnou součástí dokumentace pacientky a jsou archivovány v souladu se zákony.

Testovaný soubor byl rozdělen dle výsledků histopatologického vyšetření (benigní, maligní) z operačních výkonů a k nim byla vytvořena kontrolní skupina pacientek. Pacientky byly rozděleny přibližně početně stejně podle věku, menopauzálního statutu, BRCA mutačního stavu, anamnézy hormonální terapie (tab. 1). V tab. 2 ještě podrobně uvádíme zastoupení pacientek ve skupině s maligními nádory, kam jsme ale zařadili všechny pacientky operované v 2022–2023 (za 12 měsíců). Rozdělení dle stadií kopíruje reálný stav distribuce stadií onemocnění v populaci při absenci screeningové metody a při pozdní klinické manifestaci onemocnění.

Vzhledem k primárně deskriptivnímu charakteru projektu byl počet pacientek stanoven pragmaticky s ohledem na možnosti laboratorního stanovení. Ke statistickému vyhodnocení byly použity popisné statistiky dle charakteru dat, tj. počty a procentuální zastoupení pro kategoriální charakteristiky a medián a mezikvartilové rozpětí (IQR) či průměr a směrodatná odchylka (SD) pro spojité charakteristiky. Pro porovnání hladin VEGF-D v hodnocených skupinách pacientek byl použit neparametrický Mann-Whitney U test (M-W-U test). Kruskal-Wallis test byl použit jako statistická neparametrická metoda ke srovnání tří skupin. Všechny statistické analýzy byly uvažovány na hladině významnosti 5 % a pro jejich zpracování byl využit software MedCalc verze 23.0.6. a software R.

 

Materiální a přístrojové postupy

Vyšetření provádíme metodou ELISA (enzyme linked immune – sorbent – assay) – Quantikine® Human VEGF D (R&D Systems), který používá sendvičový formát ELISA, v němž jsou použity dvě protilátky. Jedna protilátka je imobilizována na destičce a slouží k zachycení VEGF-D, zatímco druhá je konjugována s enzymem a používá se k detekci. Po navázání protilátky na VEGF-D se přidá substrát, který reaguje s enzymem a vytváří barevnou reakci. Intenzita této barvy je úměrná množství VEGF-D ve vzorku séra a měří se na spektrofotometru – readeru TECAN.

 

Výsledky

Parametry souboru

Do výzkumného projektu bylo zařazeno celkem 162 pacientek s průměrným věkem 58 let (20, 84). Celkem 103 (64 %) pacientek bylo v době odběru krevního séra premenopauzálních, 59 (36 %) pacientek bylo v době odběru krevního séra postmenopauzálních. V analyzované skupině byl dle anamnestických dat medián věku menopauzy 50 let (36,0; 60,0), průměr 49,6 let, u 67 pacientek data o věku menopauzy nebyla k dispozici (tab. 1).

V souboru bylo 21 pacientek BRCA1 pozitivních (13 %), 17 pacientek pozitivních pro BRCA2 (11 %), do kategorie jiných patologických mutací patří mutace v souboru genů Lynchova syndromu II (PALB2, CHEK2, RAD51) (tab. 1).

Z analýzy anamnestických dat se zaměřením na hormonální terapii negovalo celkem 92 (58 %) pacientek užívání hormonálních preparátů. Ze skupiny s pozitivní odpovědí celkem 39 (25 %) pacientek užívalo někdy hormonální antikoncepci (HAK), ve skupině s maligními tumory vaječníku byly tři (5,6 %) pacientky uživatelky HAK, zatímco 43 (80 %) žen nikdy HAK neužívalo. Hormonální substituční terapie byla ve sledovaném souboru zastoupena pouze v osmi případech (5,1 %), v polovině ve skupině pacientek s maligním tumorem (čtyři pacientky, 7,4 %), tři pacientky (6,4 %) byly ve skupině s benigními tumory a jedna pacientka (1,8 %) ve skupině kontrol. Celkem tři pacientky ze souboru (po jedné pacientce v každé analyzované skupině) měly v anamnéze užívání jiných hormonálních preparátů: norethisteron, tamoxifen, aromatázový inhibitor (tab. 1).

Ze subjektivních údajů byl v prvotní dokumentaci (konziliární gynekologické vyšetření nebo vyšetření v preventivní ambulanci, které těsně předcházelo laboratornímu odběru) vyhledán údaj o symptomech. Celkem 62 (38 %) pacientek mělo pozitivní údaj (bolest trupu různé lokalizace: břicho, bedra, pánev, nepravidelné gynekologické krvácení, gastrointestinální symptomatologie: nechutenství, zvracení, nevolnost, poruchy vyprazdňování stolice, změny tělesné hmotnosti). Ve skupině pacientek s maligním tumorem mělo některý z vyjmenovaných symptomů 40 (74 %) pacientek. Ve skupině s benigními tumory bylo 21 (45 %) pacientek symptomatických. V kontrolní skupině zdravých pacientek vyjádřila potíže jedna pacientka (1,6 %) (tab. 1).

V tab. 2 uvádíme soubor pacientek s maligním tumorem rozdělený dle rozsahu postižení do stadií dle klasifikace Mezinárodní federace gynekologů a porodníků (FIGO – International Federation of Gynecology and Obstetrics). Celkem 54 pacientek za 12 měsíců (v roce 2022 a 2023) bylo operováno pro karcinom ovaria, dle výsledků histopatologického vyšetření z operačního výkonu a dle výsledků stagingových vyšetření předoperačně bylo určeno stadium FIGO. Tento soubor kopíruje populační distribuci klinických stadií u karcinomu ovaria při absenci populační screeningové metody a dlouhém asymptomatickém průběhu, kdy symptomatická jsou právě červeně vyznačená pokročilá stadia (tab. 2).

Analýza sérových hladin VEGF-D

Sérové hladiny VEGF-D se spektrofotometricky měří v ng/l. V analyzovaném souboru byla minimální naměřená hodnota 114, maximální hodnota 1 625. Medián hodnot byl 410 a průměrná hodnota 457. Ve skupině pacientek s maligním tumorem byl medián 345 (114, 756) a průměrná hodnota 378 (tab. 3).

Ve skupině pacientek s benigním tumorem byla hodnota mediánu 474 (187, 900), průměrná hodnota byla 470 (tab. 3).

Zdravé kontroly měly hodnotu mediánu 488 (157, 1 625), průměrnou hodnotu pak 517 (tab. 3).

Výsledek srovnání deskriptivních statistických parametrů pomocí Mann-Whitney U testu je ve vyšetřovaném souboru statisticky významný (p = 0,00067) (graf 1) pro rozdíl mezi hodnotami sérového VEGF-D v souboru benigních lézí a maligních tumorů (tab. 3). Dále existuje statisticky významný rozdíl mezi hodnotami pacientek s maligními tumory a mezi zdravými kontrolami (p = 0,0008). Mezi hodnotami u pacientek s benigními lézemi a u zdravých kontrol nebyl nalezen statisticky významný rozdíl (p = 0,4308) (tab. 3). Pod tabulkou následuje box graf (boxplot), krabicový diagram s vizualizací dat a jejich rozložením (graf 1). Na ose y jsou hodnoty sérového VEGF-D, na ose x potom jednotlivé kategorie pacientek.

Následuje grafické znázornění výsledků ve formě bodového grafu (scatter plot, strip plot) (graf 2). Barevné body reprezentují jednotlivé naměřené hodnoty sérového VEGF-D na ose y a na ose x je spojitý parametr – věk. Barevně, viz legenda grafu, jsou odlišeny histologické výsledky nálezů. Data vykazují velkou variabilitu (rozptyl hodnot), nelze vypozorovat trend hodnot v žádné porovnávané skupině vzhledem k věku. Výhodou tohoto zobrazení je rychlá identifikace odlehlých (extrémních) hodnot.

Vzhledem k tomu, že porovnáváme tři skupiny dat, používáme grafický výstup z Kruskal-Wallis testu za účelem zjištění, zda se hodnoty mezi těmito skupinami statisticky významně liší: p = 0,0013, což znamená, že mezi alespoň dvěma skupinami existuje statisticky významný rozdíl v hodnotách VEGF-D (graf 3).

Výsledky analýzy sérových hladin VEGF-D ve vztahu k dalším parametrům

V tab. 4 prezentujeme další sledované parametry ve vyšetřovaných skupinách. Informace o přítomnosti ascitu v pánvi a dutině břišní byly vyhledávány v operačních protokolech, nejednalo se o údaj ze zobrazovacích metod. Ascites je v souboru přítomen u 25 pacientek (15 %) všech případů, z toho u benigních lézí u 5 pacientek (11 %), u maligních tumorů ve 20 případech (37 %). Ascites může být přítomen i u benigních adnextumorů, typicky u fibromů a thékomů (v odborné literatuře tento jev bývá označován jako tzv. Meigsův syndrom). Ascites byl hodnocen pouze formou ano/ne a nebyl vztahován k dalším parametrům tabulky.

 

Grafické srovnání hladin markerů VEGF-D a CA125 ve skupinách pacientek s benigními lézemi, maligními tumory a u zdravých kontrol

V bodovém grafu je každý bod reprezentován jedním klinickým případem a znázorňuje hodnotu VEGF-D na ose y a hodnotu CA125 na ose x v séru. V grafu jsou přesně vidět již popsané výsledky: maligní tumory mají vyšší hodnoty CA125 a nižší hodnoty VEGF-D než benigní léze a zdravé kontroly (graf 4).

 

Grafické srovnání hladin markerů VEGF-D a HE4 ve skupinách pacientek s benigními lézemi, maligními tumory a u zdravých kontrol

V tomto grafickém zobrazení – bodový graf – je každý bod jeden klinický případ a je zastoupen hladinou sérového VEGF-D na ose y a hodnotou sérového HE4 na ose x. Je evidentní, že většina maligních nádorů má elevovaný HE4 a zároveň nízkou hladinu VEGF-D. Skupina maligních tumorů je v tomto zobrazení jasně oddělená od skupiny pacientek s benigními tumory a zdravými kontrolami. Naopak benigní léze a zdravé tumory mají podobné hodnoty obou markerů (graf 5).

Diskuze

Retrospektivní design studie byl zvolen pro jasnou stratifikaci pacientek do skupin na základě již známého histopatologického výsledku vyšetření odoperovaných vaječníků a vejcovodů. Skupina zdravých kontrol byla doplněna z pacientek z preventivní ambulance operovaných z profylaktických důvodů, kde byly známé negativní výsledky vyšetření. Tím jsme se záměrně dopustili selekční bias, avšak cílem bylo vybrat skupinu pacientek s nezpochybnitelně negativním nálezem na adnexech.

Velikost vzorku byla stanovena pragmaticky s ohledem na dobu uchovávání prebiopticky odebraných vzorků sér v biobance Masarykova onkologického ústavu (MOÚ), tj. 12 měsíců. Druhým hlediskem pro velikost vzorku byly možnosti provedení analýz v laboratořích Oddělení laboratorní medicíny MOÚ za plného standardního provozu. Záchyt nových pacientek s karcinomem ovaria je již několik let přibližně stejný a pohybuje se okolo čísla 50. Tedy konkrétně k 54 vzorkům od pacientek s maligním tumorem za období 2022–2023 byly dohledány vzorky od pacientek s benigními lézemi a od zdravých kontrol tak, aby srovnávané parametry byly početně přibližně stejně zastoupeny. Navýšení počtu pacientek v tomto konkrétním uspořádání by bylo možno provést pouze v multicentrickém designu se všemi riziky plynoucími z technologických bias ve zpracování a transportu primárního vzorku séra.

Všechna séra byla odebrána vstupně prebiopticky a prošla stejným procesem zmrazení. Obrácený postup – rozmrazování sér – byl rovněž identický. Nebyla vyšetřována žádná nativní séra.

Vyšetřování hladin VEGF v séru je komplikované procesem krevní srážlivosti. Celkově proces srážení krve zahrnuje komplexní interakce mezi koagulačními faktory, destičkami, endoteliálními buňkami a růstovými faktory, což může vést ke změnám v sérových hladinách různých angiogenních faktorů, včetně VEGF. Z posledně uvedeného je evidentní, že by měl navazovat projekt vyšetřující hladiny VEGF-D v plazmě neovlivněné proběhlými koagulačními procesy.

Analýza VEGF-D v séru metodou ELISA může mít jisté nedostatky v analytickém principu: jedna specifická protilátka vychytává jednu specifickou izoformu VEGF-D. Z uvedených informací v úvodu sdělení je prokázáno, že VEGF-D je různými proteázami štěpen na různé izoformy. Je tedy otázkou, zda získané nízké hodnoty sérového VEGF-D u pacientek s maligními tumory jsou správné a reprezentují skutečné množství VEGF-D produkované tumorem. Řešením by bylo provedení některé z multiplexových metod (např. Luminex) nebo analýzy metodou hmotnostní spektrofotometrie či microarray technologie.

Nutno je zvažovat i fakt, že nádorem produkované izoformy VEGF-D mohou být vázány v extracelulární formě a jenom malá solubilní frakce se uvolňuje do krevního řečiště. Zde by bylo zajímavé provést stejný design studie doplněný o imunohistochenickou analýzu proteinu VEGF-D ve tkáních maligních tumorů, benigních lézí a ve tkáních od zdravých kontrol.

Z uvedených prací na karcinomech kolorekta a plic v úvodu dizertační práce se nejvíce ztotožňujeme s vysvětlením nízkých sérových hladin VEGF-D u pacientů s malignitou principem kompetitivní inhibice substrátů (členů rodiny VEGF) o vazbu na receptory.

Dosud stále platí, že pozdní záchyt onemocnění karcinomem vaječníku je zásadní příčina jeho špatné prognózy. Zatím nebyl identifikován žádný dostatečně senzitivní a specifický marker ani multivariantní analýza kombinující markery a zobrazovací metody, které by jednoznačně diferencovaly skupinu obtížně ultrazvukově rozlišitelných adnextumorů. Zejména je to zásadní pro mladší pacientky ve fertilním věku, u nichž se snažíme minimalizovat zbytečné operační vstupy. Nejčastější typ ovariálního karcinomu – high-grade serózní karcinom – vzniká ve většině případů jako diseminovaný extrapelvický tumor. Ani jeho prekurzorová léze STIC není k dnešnímu dni identifikovatelná jinak než morfologicky v epitelu fimbriální části vejcovodu. Angiogeneze, resp. lymfangiogeneze jako základní znak maligních tumorů je předmětem intenzivního výzkumu. Nicméně role lymfatického systému je v nádorové biologii poněkud konfliktní: lymfatická síť představuje distribuční prostor pro maligní elementy, zároveň je to soustava sloužící jako bariéra proti nádorové diseminaci. Angiogenním faktorem, který je prokazatelně overexprimován v maligních tumorech a přispívá k nádorové lymfangiogenezi a remodelaci krevních a lymfatických cév, je VEGF-D.

 

Závěr

V práci předkládáme analýzy sérových hladin VEGF-D ve skupině pacientek s maligními tumory, benigními lézemi adnex a u zdravých kontrol. Výsledek srovnání deskriptivních statistických parametrů pomocí Mann-Whitney U testu je ve vyšetřovaném souboru statisticky významný pro rozdíl mezi hodnotami sérového VEGF-D v souboru benigních lézí a maligních tumorů. Dále existuje statisticky významný rozdíl mezi hodnotami pacientek s maligními tumory a mezi zdravými kontrolami. Ve srovnání s konvenčním markerem – zlatým standardem CA125 – korelovala patologicky zvýšená hladina sérového CA125 s nízkou hodnotou sérového VEGF-D u pacientek s maligními tumory. Stejná shoda panovala ve srovnání s markerem HE4: vysoké sérové hladiny HE4 byly ve skupině pacientek s maligním tumorem doprovázeny nízkou hladinou VEGF-D, v naší analýze se kombinace markeru HE4 a VEGF-D v grafickém zpracování jevila diagnosticky přesnější.

S ohledem na získané výsledky má vyšetřování sérové hladiny VEGF-D potenciál diagnostického testu s přínosem ke stratifikaci obtížně prebiopticky diferencovatelných adnextumorů. K přesnému ověření uvedeného závěru je nutno ještě dalších analýz, především v prospektivním designu.